Диагностика смарт: SMART диагностика — Медицинский центр «Верум»Медицинский центр «Верум»

10.3 Тканевая инженерия кровеносных сосудов 329

10.4 Заключение и перспектива 344

Благодарность 345

Литература 345

Том 2

Предисловие xv

Предисловие xvii3 110009

18.1 Введение 575

18.2 Биология почек 576

18.3 Обзор развития почек и васкуляризации 578

18.4 Разработка 581

18.5 Технологии на основе биологических каркасов 587

18.6 Выводы и будущие направления 594

Благодарности 595

Ссылки 595

19 Дизайн и проектирование тканей 603
Мухаммад Н. Хасан и Умут А. Гуркан

19.1 Введение 603

19.2 Природные биоматериалы для восстановления нервной ткани 605

19.3 Синтетические биоматериалы для восстановления нервной ткани 623

19.4 Разработка нанофиброзных каркасов 625

19.5 Резюме и направление на будущее 634

Источники 634

20 Нейро-тканевые инженерные вмешательства при травматической травме головного мозга в эллиптическом пространстве 655 903 Эль Сибай, Стефания Монделло и Фирас Кобейси

20.1 Введение 655

20.2 Нейрогенез в ЦНС: резидентные нейронные стволовые клетки 657

20.3 Клеточные и нейрозащитные терапевтические стратегии 658

20.4 Технология создания: подход к биоматериалам 663

20.5 Применение в живой системе: трансляционные подходы 668

20.6 Перспективы на будущее: переход в клинику 669

Ссылки 671

21 Bueion Инженерное дело 677
Тхань Д. Нгуен и Брайан П. Тимко

21.1 Введение 677

21.2 Электроника для биоинтерфейсов 678

21.3 Новые источники энергии 688

21,4 3D-печать 692

21,5 Выводы и направления на будущее 695

Ссылки 695

Индекс 701

Беспроводные интеллектуальные контактные линзы для диагностики и терапии диабета

Abstract

Можно использовать интеллектуальные контактные линзы как отличный интерфейс между человеческим телом и электронным устройством для носимых медицинских приложений. Несмотря на широкие исследования интеллектуальных контактных линз для диагностических приложений, не было сообщений об электрически контролируемой доставке лекарств в сочетании с биометрическим анализом в реальном времени.Здесь мы разработали умные контактные линзы как для непрерывного мониторинга уровня глюкозы, так и для лечения диабетической ретинопатии. Устройство для интеллектуальных контактных линз, построенное на основе биосовместимого полимера, содержит ультратонкие гибкие электрические схемы и микросхему микроконтроллера для электрохимического биосенсора в реальном времени, контролируемой доставки лекарств по запросу, беспроводного управления питанием и передачи данных. На моделях кроликов с диабетом мы могли измерять уровни глюкозы в слезах, чтобы их подтвердить с помощью обычных инвазивных тестов на уровень глюкозы в крови, и запускать выброс лекарств из резервуаров для лечения диабетической ретинопатии.Вместе мы успешно продемонстрировали возможность использования умных контактных линз для неинвазивной и непрерывной диагностики диабета и терапии диабетической ретинопатии.

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время мягкая биоэлектроника была широко исследована, чтобы использовать преимущества присущих ей полимерных свойств и органической электроники для носимых и имплантируемых медицинских устройств ( 1 , 2 ). На основе этого нововведения было разработано множество видов медицинских устройств для диагностического ( 3 ), терапевтического ( 4 ) и тераностического применения ( 5 ).Носимые устройства успешно применяются для непрерывного мониторинга уровня глюкозы ( 5 ), электрокардиографии ( 6 ), электромиографии ( 7 ), фотоплетизмографии и пульсоксиметрии ( 8 ). Они могут предоставить важную медицинскую информацию для наблюдения за состоянием здоровья и диагностики различных заболеваний. Кроме того, было разработано новаторское полупроводниковое имплантируемое устройство доставки лекарств для применения в подкожной жидкости ( 9 ), что положило начало разработке имплантируемых систем доставки лекарств по требованию ( 10 ).Комбинируя эти технологии вместе, было разработано множество видов медицинских устройств для тераностических приложений на стыке биологических, наноразмерных и электронных технологий ( 5 , 11 — 13 ).

Среди различных носимых устройств здравоохранения интеллектуальные контактные линзы привлекли большое коммерческое внимание для приложений здравоохранения ( 14 , 15 ). Поверхность роговицы уникальным образом представляет собой удобный и неинвазивный интерфейс для физиологических условий в организме человека.Глаза напрямую связаны с мозгом, печенью, сердцем, легкими и почками и могут служить окном в тело ( 16 ). В этом контексте компания Sensimed выпустила одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) продукт, Triggerfish, для мониторинга внутриглазного давления у пациентов с глаукомой в 2016 году ( 14 , 15 ). Кроме того, Google разработал линзу Google для диагностики пациентов с диабетом в сотрудничестве с Novartis ( 15 ). Эти умные контактные линзы особенно важны, потому что они делают возможным неинвазивный и непрерывный мониторинг глаукомы и диабета, соответственно.Кроме того, были разработаны интеллектуальные носимые сенсорные системы, интегрированные в мягкие контактные линзы, для измерения изменения сопротивления графеновых сенсоров при связывании глюкозы для дистанционного мониторинга диабета ( 17 , 18 ). Однако электрический ток и изменения цвета в датчиках были пропорциональны в логарифмической шкале концентрациям глюкозы, что могло быть недостаточно для измерения реальной концентрации глюкозы для точной диагностики диабета.

Здесь мы разработали интеллектуальную контактную линзу с дистанционным управлением для неинвазивного мониторинга глюкозы и контролируемой доставки лекарств для лечения диабетической ретинопатии.Многофункциональная интеллектуальная контактная линза состоит из пяти основных частей: электрохимического биосенсора в реальном времени, гибкой системы доставки лекарств по запросу (f-DDS), резонансной индуктивной беспроводной системы передачи энергии, микроконтроллера на базе дополнительной интегральной схемы (IC). микросхема с блоком управления питанием (PMU) и системой удаленной радиочастотной (RF) связи (рис. 1). Амперометрический биосенсор в реальном времени предназначен для обнаружения глюкозы в слезах, заменяя необходимость инвазивных анализов крови.Лекарства могут быть выпущены из саморегулируемого пульсирующего f-DDS с помощью удаленной связи. Резонансная индуктивная связь с медной (Cu) катушкой приемника позволяет получать беспроводное питание от внешнего источника питания с катушкой передатчика. Устройство взаимодействует с внешним контроллером посредством радиочастотной связи. Мы оценили и обсудили возможность использования этих умных контактных линз для диагностики диабета и терапии диабетической ретинопатии.

В интеллектуальную контактную линзу встроены биосенсор, f-DDS, система беспроводной передачи энергии от катушки передатчика к катушке приемника, микросхема ASIC и система удаленной связи в качестве повсеместной платформы для различных диагностических и терапевтических приложений.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Приготовление и характеристика силиконовых гидрогелей для контактных линз

Были приготовлены силиконовые гидрогели для контактных линз с химической структурой, схематически показанной на рис. S1A.Силикон-гидрогели были изготовлены в виде контактной линзы диаметром 14 мм, толщиной 200 мкм и радиусом кривизны 8,0 мм. Инфракрасная спектроскопия с ослабленным полным отражением с преобразованием Фурье (ATR-FTIR) показала четкие пики, соответствующие химическому присоединению добавленных мономеров (рис. S1B). Длины волн пяти пиков были хорошо согласованы с таковыми у коммерческих силикон-гидрогелевых контактных линз из лотрафилкона А. Контактные силикон-гидрогелевые контактные линзы демонстрировали почти сравнимый коэффициент пропускания с таковым у контактных линз из поли (гидроксиэтилметакрилата) (PHEMA) гидрогеля в качестве контроля в видимый диапазон длин волн (рис.S1C). Равновесное содержание воды (EWC) в контактных линзах из силикон-гидрогеля составляло 33,6%, что было выше, чем у контактных линз из гидрогеля PHEMA (21,3%) и лотрафилкона A (24%) (рис. S1D) из-за высокого соотношения гидрофильные силиконсодержащие мономеры. Диаметр силикон-гидрогелевой линзы увеличился всего на 1-15 мм, тогда как диаметр гидрогелевой линзы PHEMA увеличился на 2-16 мм. Гидрофильность поверхности контактной линзы из силикон-гидрогеля контролировалась обработкой озоновой плазмой.Контактная линза из силикон-гидрогеля с обработанной поверхностью показывала меньший угол контакта с водой, чем контактная линза из гидрогеля PHEMA в каждый момент времени (рис. S1E), и капля воды быстро впитывалась в контактную линзу из силикон-гидрогеля (рис. S1F).

Электрическое определение концентрации глюкозы в слезе в реальном времени in vitro

Глазной датчик глюкозы был разработан с тремя электродами, чтобы иметь низкое электрическое сопротивление для облегченной электрохимической реакции глюкозы (рис.2А). Рабочий электрод (WE) и противоэлектрод (CE) были приготовлены из платины (Pt) для эффективной электрохимической реакции. Чтобы улучшить адгезию между полиэтилентерефталатом (ПЭТ) и Pt, слой Cr был нанесен на подложку из ПЭТ в качестве адгезионного слоя перед нанесением слоя Pt. Электрод сравнения (RE), покрытый серебром / хлоридом серебра (Ag / AgCl), повысил точность амперометрического электрохимического датчика глюкозы в жидкой среде, обеспечивая постоянное напряжение на WE во время измерения глюкозы.Чтобы контролировать содержание глюкозы в слезах с высокой чувствительностью и стабильностью, мы покрыли WE смешанным раствором глюкозооксидазы (GOx), бычьего сывороточного альбумина (BSA), поливинилового спирта (PVA) и хитозана. После сушки к сшиванию хитозана и ПВС добавляли глутаральдегид для иммобилизации GOx с BSA. Чтобы подтвердить сильную корреляцию между уровнями глюкозы в крови и слезах, их концентрации у нормальных и диабетических кроликов были измерены до и после трехкратного кормления и голодания.Кролики с диабетом показали более высокие концентрации глюкозы как в слезах, так и в крови, чем у нормальных кроликов (рис. 2В). Эти уровни глюкозы в крови и слезах, по-видимому, находятся в разумном диапазоне, потому что нормальный уровень глюкозы в крови для недиабетиков во время голодания составляет от 70 до 130 мг дл ^-1 ( 19 ). Из-за большого временного интервала отбора проб мы не смогли наблюдать время задержки в увеличении концентрации глюкозы между кровью и слезой, как описано в другом месте ( 19 ).Однако мы прояснили повторяющуюся сильную корреляцию между уровнем глюкозы в крови и слезой. Эти результаты показали возможность измерения уровня глюкозы в слезах в качестве альтернативы измерению уровня глюкозы в крови для диагностики диабетических заболеваний.

( A ) Схематическое изображение глазного сенсора глюкозы с тремя электродами (WE, рабочий электрод; RE, электрод сравнения; CE, противоэлектрод) и механизм измерения глюкозы в слезах.( B ) Корреляция между уровнями глюкозы в крови и слезах у нормальных и диабетических кроликов. ( C ) Электрическое определение концентраций глюкозы в реальном времени по сравнению с PBS. ( D ) Текущее изменение сенсора глюкозы, показывающее селективность до 0,35 и 0,7 мг дл ^-1 аскорбиновой кислоты (АК), 22,5 и 45 мг дл ^-1 лактата, 18 и 36 мг дл ^-1 мочевина и 5 мг дл ^-1 глюкозы. ( E ) Долгосрочная стабильность сенсора глюкозы после хранения в течение 0, 21, 42 и 63 дней ( n = 3).

Как показано на рис. 2C, мы могли измерить концентрацию глюкозы в реальном времени по изменению электрического тока in vitro с помощью потенциостата. Ток увеличивался с 0,41 до 3,12 мкА с увеличением концентрации глюкозы с 5 до 50 мг дл ^-1 . Этот диапазон изменения тока может быть подходящим для удаленного мониторинга физиологического уровня глюкозы. Чтобы оценить селективность по отношению к глюкозе, мы применили потенциально мешающие молекулы аскорбиновой кислоты (A), лактата (L) и мочевины (U) в слезе (рис.2D). Сообщается, что концентрации ALU составляют около 0,70 мг дл ^-1 для A ( 20 ), от 18 до 45 мг дл ^-1 для L ( 21 ) и 36 мг дл ^-1 для У ( 20 ) в разрыве. Когда соответствующие концентрации мешающих молекул (A, L и U) были добавлены в систему измерения глюкозы, наблюдался лишь небольшой шум с незначительным изменением тока. В отличие от A, L и U, добавление 5 мг дл ^-1 глюкозы быстро увеличивало ток до 0.42 мкА. Кроме того, мы оценили долгосрочную стабильность сенсоров глюкозы (рис. 2E). После изготовления умные контактные линзы хранили в стерилизованном фосфатно-солевом буфере (PBS) при температуре от 20 до 25 ° C, что было аналогично реальной среде хранения контактных линз, в течение 21, 42 и 63 дней. Работа сенсоров глюкозы поддерживалась стабильно с отклонением менее 2% в течение 63 дней ( n = 3).

Высвобождение f-DDS по требованию

f-DDS был изготовлен с размерами 1.5 мм на 3 мм на 130 мкм (рис. 3, А и Б). Отслаивающий слой и буферный слой оксида кремния (SiO ₂ ) были нанесены на стеклянную подложку, а резервуар с лекарством был покрыт бездефектным Au анодным электродом. Процесс лазерного отрыва (LLO) с использованием эксимерного лазера локально расплавил и диссоциировал отшелушивающий слой. Буферный слой SiO ₂ поддерживал верхний слой устройства во время процесса LLO и блокировал тепловой поток, генерируемый во время вызванного лазером отслаивания.Помимо управления продолжительностью лазерного выстрела, толщина буферного слоя SiO ₂ была важным фактором для минимизации теплового повреждения устройства во время процесса LLO. Мы использовали два разных фоторезиста СУ8-5 и СУ8-50. SU8-5 имеет меньшую вязкость и прочность, чем SU8-50. Соответственно, SU8-5 использовался для изоляции электрода, за исключением того, что место высвобождения лекарства для стабильной работы f-DDS и SU8-50 использовалось для создания DDS. Поперечная сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) показала электроды и изолированные слои резервуара (рис.S2). Испытание на механический изгиб проводилось для оценки механической надежности f-DDS на гибкой подложке (рис. S3, A и B). Рабочий ток f-DDS поддерживался без каких-либо заметных изменений во время испытания на механическую прочность до 1000 циклов (рис. S3C).

( A ) Схематическое изображение изготовления f-DDS. (i) выращивание буферного слоя диоксида кремния (SiO ₂ ) на стеклянной подложке; (ii) нанесение металлов Ti, Au и Ti на анодные и катодные электроды; (iii) формирование паттернов резервуаров лекарственного средства SU8; (iv) загрузка лекарств; (v) прикрепление ПЭТ и лазерного сканирования устройства; (vi) отсоединение f-DDS; и (vii) травление Ti с изоляцией SU8.( B ) Фотография f-DDS. Фото: Бом Хо Мун, KAIST. ( C ) СЭМ-изображения f-DDS до и после электрохимического теста золота. Масштабная линейка 250 мкм. ( D ) Конфокальные флуоресцентные микроскопические изображения красителя родамина B, высвобождаемого из резервуаров с лекарственным средством. Масштабные линейки 300 мкм (слева) и 500 мкм (справа). ( E ) Текущее изменение f-DDS. ( F ) Пульсирующее высвобождение концентрации генистеина. ( G ) Нормализованное содержание генистеина, выпущенного из резервуаров ( n = 6) по сравнению с исходным содержанием загрузки.

Загруженные лекарства избирательно высвобождались из резервуара с лекарствами посредством включения / выключения управления напряжением. Как показано на СЭМ-изображении Au анодного электрода, тонкая Au мембрана покрывала всю площадь резервуаров с лекарством без какой-либо утечки лекарств (рис. 3C, слева). После приложения электрического напряжения 1,8 В Au-мембрана растворилась в течение 40 с (рис. 3С, справа). Слой Au плавили в PBS при постоянном напряжении в виде AuCl ₄ ^— . Конфокальная флуоресцентная микроскопия показала, что красный родаминовый краситель высвобождается из резервуара под действием электрического потенциала (рис.3D). Ток между анодом и катодом увеличился до 6,08 ± 0,16 мкА, а аноды из Au медленно растворялись при небольшом уменьшении тока с 6,08 ± 0,16 мкА до 4,35 ± 0,11 мкА (рис. 3E). Генистеин выпускался пульсирующим образом из трех различных резервуаров с лекарственным средством (рис. 3F). Анод медленно растворялся током в микромасштабе, и лекарство почти полностью высвобождалось после того, как ток был восстановлен до исходного состояния. Мы смогли обнаружить 89,97 ± 37,10% загруженного генистеина в PBS, подтверждая, что терапевтическое количество препарата может высвобождаться из f-DDS (рис.3G). Кроме того, терапевтическое количество метформина для диабетиков могло быть высвобождено из интеллектуальной контактной линзы за счет синхронизированной обратной связи для терапии в месте оказания помощи и других тераностических приложений (рис. S3D).

Беспроводная передача энергии и удаленная связь

Система беспроводной передачи энергии была разработана посредством резонансной индуктивной связи. Катушка приемника, встроенная в интеллектуальную контактную линзу, получает различную электрическую мощность от катушки передатчика в зависимости от расстояния (рис.S4A). Эффективность беспроводной передачи энергии между двумя катушками измерялась анализатором цепей, которая обратно пропорциональна расстоянию (рис. S4A). Требуемая потребляемая мощность PMU, блока считывания датчиков и блока удаленной связи (RCU) на интеллектуальной контактной линзе составляла 43, 34,4 и 2,3 мВт соответственно (рис. S4B). RCU передавал данные со скоростью 445 кбит / с ^-1 в полосе частот 433 МГц, применяемой для промышленности, науки и медицины (ISM) с использованием двухпозиционной модуляции, и им можно было управлять для отключения для экономии энергии, когда данные были не передается.Используя резонансную индуктивную связь, микросхема специализированной интегральной схемы (ASIC), подключенная к дополнительному конденсатору для хранения энергии, успешно принимала электромагнитную энергию на расстоянии 1 см от катушки передатчика с эффективностью 2%. Эффективности было достаточно для поддержания базовой работы и удаленной связи смарт-контактной линзы. Средний выходной код аналого-цифрового преобразователя (АЦП) из микросхемы ASIC был пропорционален входному току (рис.S5, A и B). Общее преобразование входного сигнала было доступно до 4,1 мкА с разрешаемым входным значением 150 пА, что подходило для электрического определения глюкозы с помощью глазного сенсора глюкозы. Глазной датчик глюкозы и f-DDS работали под управлением микросхемы ASIC путем приложения соответствующих напряжений смещения (рис. S5, B и C). Преобразованные данные биосенсора были сериализованы микросхемой ASIC и успешно переданы на внешнее устройство персонального компьютера (ПК) с использованием беспроводной системы питания и удаленной связи (рис.S5D).

Изготовление и оценка интегрированной интеллектуальной контактной линзы

На основе предварительных экспериментальных результатов была изготовлена ​​интеллектуальная контактная линза путем химического сшивания раствора предшественника силикон-гидрогеля, содержащего пленку ПЭТ, в которую был встроен биосенсор глюкозы. , f-DDS, микросхему ASIC, медный приемник энергии и радиочастотные коммуникационные катушки, пассивированные париленом C (рис. S6A). Катушка считывающего устройства, которая была подключена к коммерческому усилителю мощности, передавала по беспроводной сети достаточную электрическую мощность на интеллектуальную контактную линзу для определения уровня глюкозы в слезах в реальном времени и дистанционного управления f-DDS (рис.S6B). На RE электрохимического сенсора глюкозы подавали постоянный потенциал, что обеспечивало высокую чувствительность и стабильность. Выходные данные биосенсора передавались по беспроводной сети с помощью удаленной связи с использованием специализированного модуля приемника амплитудной манипуляции (ASK), Alf Vergard Risc (AVR) и ПК. Дистанционно переданные данные показали, что текущее изменение сенсора глюкозы было пропорционально приложенному уровню глюкозы in vitro, что подтвердило возможность беспроводного электрического определения глюкозы в реальном времени с помощью интеллектуальной контактной линзы (рис.S6C). Значения изменения выходного тока от 0,40 до 3,13 мкА были аналогичны значениям измерения глюкозы с использованием потенциостата in vitro на рис. 2С. Кроме того, доставка лекарств по запросу была продемонстрирована с помощью дистанционного управления микросхемой ASIC для подачи постоянного напряжения 1,8 В на f-DDS (рис. S6C). Контактные линзы из силикон-гидрогеля с высоким содержанием воды не вызывали каких-либо существенных повреждений биосенсора, f-DDS и других компонентов микронного размера.

In vivo диагностические и терапевтические применения смарт-контактных линз

Перед применением in vivo безопасность интегрированных смарт-контактных линз оценивалась на глазах новозеландских белых кроликов в течение 5 дней (рис.S7). Гистологический анализ извлеченных глаз кроликов с окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) не показал каких-либо заметных повреждений эпителия роговицы, стромы и эндотелия кроликов после ношения умных контактных линз в течение 3 и 5 дней по сравнению с нормальной роговицей кроликов. . Хотя наши умные контактные линзы вызывали некоторую степень отека роговицы, через 5 дней она не вызвала воспалительной реакции. Набухание роговицы, вероятно, было вызвано плохой передачей кислорода через закрытое веко во время сна при ношении контактных линз, что приводит к накоплению молочной кислоты и воды внутри роговицы в результате осмотического сдвига.Никаких инфекций, серьезных побочных реакций или изменений на поверхности глаза при установленной линзе не наблюдалось. В целом, наши результаты продемонстрировали предварительную безопасность смарт-контактных линз при наложении на глаз.

После этого мы провели оценку интегрированных смарт-контактных линз на глазах кроликов, больных диабетом, для приложений биочувствительности и доставки лекарств, как схематично показано на рис. 4A. Встроенная беспроводная интеллектуальная контактная линза только для определения уровня глюкозы (рис. S8A) или для определения уровня глюкозы и доставки лекарства (рис.S8B) носился на кроличьем глазу и управлялся посредством беспроводной передачи энергии между внешней катушкой передатчика и катушкой приемника на интеллектуальной контактной линзе (рис. S8C). В конечном итоге портативную систему передачи энергии можно установить на интеллектуальных очках или смартфонах, как схематично показано на фиг. 4A. Диабетическим кроликам вводили инсулин, анестезировали кетамином и надевали наши умные контактные линзы (фильм S1). После ношения смарт-контактных линз глазной датчик глюкозы показал повышение концентрации глюкозы до 30.53 мг дл ^-1 при контакте с глюкозой в слезах, а затем снижение до 16,72 мг дл ^-1 за счет воздействия инсулина на метаболизм глюкозы, что хорошо согласуется с профилем концентрации глюкозы в крови, определенным глюкометром (рис. . 4B). Реальный уровень глюкозы в слезе, измеренный с помощью анализа глюкозы, хорошо согласовывался с преобразованным уровнем глюкозы из значений выходного тока. Группа Парвиза ранее разработала сенсорную систему для контактных линз и выполнила беспроводной мониторинг уровня глюкозы с использованием полидиметилсилоксановой (PDMS) модели глаза ( 20 , 22 ).В то время как выходной ток онлайн-датчика находился в диапазоне от 0 до 400 нА для концентрации глюкозы от 0 до 10,81 мг дл ^-1 ( 20 ), выходной ток беспроводного датчика находился в диапазоне от 0 до 80 нА для концентрация глюкозы от 0 до 36,03 мг дл ^-1 ( 22 ). Напротив, мы беспроводным способом измеряем реальный уровень глюкозы в слезе в широком физиологически значимом диапазоне от 0 до 49,9 мг дл ^-1 in vitro и in vivo с улучшенной чувствительностью (рис.2C и 4B и фиг. S6C).

( A ) Схематическое изображение смарт-контактных линз для диагностики и лечения диабета in vivo. ( B ) Беспроводное измерение уровня глюкозы в слезе в реальном времени in vivo с помощью смарт-контактных линз. Уровни глюкозы в крови и слезах измеряли (i) после инъекции инсулина и анестезии для ношения смарт-контактных линз в PBS. (ii) Уровень глюкозы в слезах увеличился из-за глюкозы в слезах и снизился, отражая снижение уровня глюкозы в крови из-за введенного инсулина.Уровень глюкозы в крови измеряли каждые 5 минут с помощью коммерческого глюкометра. ( C ) Флуоресцентные микроскопические изображения лекарств, абсорбированных в роговице, склере и сетчатке кроликов, носящих интеллектуальные контактные линзы, загруженные (верхний ряд) и не содержащие (нижний ряд) генистеина. Шкала шкалы 0,1 мм. ( D ) Анализ с помощью инфракрасной камеры для определения температуры глаза, умных контактных линз и передающей катушки после работы в течение 0, 15 и 30 мин.

Кроме того, мы могли удаленно запускать высвобождение антиангиогенного генистеина из f-DDS на смарт-контактных линзах, прикладывая электрический потенциал по требованию.На рис. 4С показаны изображения флюоресцентной микроскопии криосрезов роговицы, склеры и сетчатки. Генистеин, высвобождаемый смарт-контактной линзой, по-видимому, эффективно доставлялся через роговицу к сетчатке. Слабая флуоресценция в склере показала, что генистеин прошел через склеру с небольшим поглощением. В случае контроля флуоресценция не наблюдалась в криосрезов тканях кроликов, носивших смарт-контактную линзу без генистеина или смарт-контактную линзу с генистеином без электрического запуска для его высвобождения (рис.4C, ниже). На основании результатов мы могли подтвердить возможность использования умных контактных линз для электрически контролируемой доставки терапевтических лекарств в глаза по требованию (таблица 1).

Инфракрасная тепловизионная камера не показала заметных изменений температуры тела смарт-контактной линзы на глазах кролика (рис. 4D). Вначале температура интеллектуальной контактной линзы составляла 32,4 ° C, поверхности глаза — 34,4 ° C и внешней катушки — 32.0 ° С. После 30 минут работы температура интеллектуальной контактной линзы составила 33,8 ° C с повышением температуры на 1,4 ° C, поверхность глаза — 34,8 ° C с повышением температуры на 0,4 ° C, а температура внешней катушки. составила 29,7 ° C при понижении температуры на 2,3 ° C. Небольшое повышение температуры показало термобезопасность наших умных контактных линз.

Терапевтический эффект генистеина, высвобождаемого из смарт-контактных линз, на диабетическую ретинопатию

Новозеландских белых кроликов разделили на пять групп для оценки терапевтического эффекта генистеина, высвобождаемого из смарт-контактных линз, на диабетическую ретинопатию по сравнению с контрольной серией и контрольной группой. группы.В левый глаз кроликов вводили глазные капли PBS для местного применения в качестве отрицательного контроля в группе 1, глазные капли генистеина для местного применения в группе 2, интравитреальную инъекцию генистеина в группе 3 и интравитреальную инъекцию авастина в качестве положительного контроля в группа 4. Правые глаза всех групп обрабатывали умными контактными линзами, содержащими генистеин (которые вместе составили группу 5). Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) визуализировала ингибирующее действие генистеина, высвобождаемого из смарт-контактных линз, на деформацию сосудистой структуры сетчатки (рис.5А). Сосуды сетчатки у диабетиков на рис. 5A (iv) (левый глаз группы 4) и рис. 5A (v) имели круглую форму, окруженную толстыми слоями эндотелиальных клеток сосудов (EC), которые были сопоставимы с таковыми у здорового кролика. ( 23 ). Однако базальная мембрана сосудов выглядела нерегулярной и складчатой ​​без прозрачного сосудистого слоя ЭК на фиг. 5A (i) (левый глаз группы 1), что отражает повышенную проницаемость сосудов и нарушение гемато-ретинального барьера. На Рис. 5A (ii) (левый глаз группы 2) и Рис.5А (iii) (левый глаз группы 3) сосуды имели круглую форму, но окружающие сосудистые слои ЭК не были такими толстыми, как на фиг. 5А (iv и v).

Глаза диабетических кроликов обрабатывали (i) глазными каплями PBS (контроль), (ii) глазными каплями генистеина, (iii) интравитреальной инъекцией генистеина, (iv) интравитреальной инъекцией Авастина и (v) генистеин выпущен из смарт-контактных линз.( A ) Электронные микрофотографии сосудов сетчатки. L — просвет сосуда; ЭК, эндотелиальная клетка; RBC, эритроциты. Масштабная линейка, 1 мкм. ( B ) Флуоресцентные ангиограммы сетчатки (стрелки, сосуды сетчатки). Масштабная линейка 0,2 мм. ( C ) Гистологический анализ повреждения пигментного эпителия сетчатки (RPE) и сосудов сосудистой оболочки (CV) (стрелки, повреждение в CV). Шкала шкалы 0,1 мм. ( D ) Обнаружение апоптоза сетчатки с помощью анализа TUNEL. Шкала шкалы 0,1 мм.( E ) Объединенные изображения иммуногистохимического окрашивания для коллагена типа 4 (красный) и PECAM-1 (зеленый) с окрашиванием ядер 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (синий). Шкала шкалы 0,1 мм. ( F ) Интенсивность флуоресценции неоваскуляризационного поражения хориоидеи сетчатки, количественно определенная по изображениям (B). ( G ) Интенсивность флуоресценции анализа TUNEL, количественно определенная по изображениям (D). ( H ) Интенсивность иммунохимической флуоресценции (E) коллагена типа 4 (закрашенная рамка), количественно определенная по изображениям на рис.S9A (красный) и PECAM-1 (пунктирная рамка), определенные количественно по изображениям на рис. S9B (зеленый) [ n = 3, * P <0,05 и ** P <0,01 по сравнению с контрольным образцом (i)].

На рис. 5В показаны флуоресцентные ангиограммы морфологии сосудов сетчатки. В то время как четкая морфология сосудов не наблюдалась на фиг. 5B (i и ii), сосуды сетчатки (стрелки) с четкой морфологией наблюдались с заметно сниженной проницаемостью сосудов сетчатки на фиг. 5B (iv и v).Флуоресценция наблюдалась по всей паренхиме сетчатки из-за увеличения сосудистой утечки после разрушения гемато-ретинального барьера, как количественно показано на фиг. 5F. На фиг. 5B (iii) наблюдалась небольшая флуоресценция только при скудной сосудистой сети. Результаты гистологического анализа H&E соответствовали результатам ПЭМ-изображений и флуоресцентных ангиограмм (рис. 5C). Кроме того, гибель клеток сетчатки была подтверждена с помощью анализа мечения ник-концов дезоксиуридинтрифосфата, опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TUNEL), на изображениях поперечных сечений сетчатки (рис.5D). Флуоресценцию теста TUNEL количественно оценивали с помощью программы ImageJ. Когда средняя интенсивность флуоресценции на фиг. 5D (i) была установлена ​​равной 100%, средний процент интенсивности флуоресценции составлял 76,0% на фиг. 5D (ii), 69,0% на фиг. 5D (iii), 37,0% на фиг. . 5D (iv) и 45,1% на фиг. 5D (v) (фиг. 5G). Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание на коллаген типа 4 и молекулу адгезии EC тромбоцитов – 1 (PECAM-1) выявило терапевтический эффект генистеина, высвобождаемого из интеллектуальной контактной линзы (рис. 5E). Степень экспрессии коллагена 4 типа и PECAM-1 на рис.S9 (iv и v), чем на рис. S9 (от i до iii) (рис. 5H).

ОБСУЖДЕНИЕ

Интеллектуальные электронные контактные линзы широко исследуются для диагностических приложений, особенно для непрерывного мониторинга уровня глюкозы и внутриглазного давления. Кроме того, было много отчетов об электрическом и оптическом измерении глюкозы с улучшенной чувствительностью с использованием различных наноматериалов ( 24 — 26 ). Для повышения чувствительности, стабильности и воспроизводимости мы иммобилизовали GOx в гидрогелях хитозана и ПВС вместе с БСА.PVA, по-видимому, смягчил проблему неравномерного покрытия и растрескивания за счет увеличения вязкости раствора смеси GOx с увеличенным модулем потерь ( 27 ). Также сообщалось, что ПВС оказывает существенное влияние на чувствительность сенсоров глюкозы ( 28 , 29 ). Как показано на рис.2, концентрации глюкозы могут быть точно измерены по изменению электрического тока с помощью нашего сенсора глюкозы, что показывает стабильность для повторного определения уровня глюкозы даже после хранения в течение более 63 дней (рис.2E) и обеспечение непрерывного мониторинга уровня глюкозы в слезе в глазах живых кроликов в реальном времени по сравнению с измерением уровня глюкозы в крови глюкометром (рис. 4B). В отличие от этого, группа Парвиза использовала модельный глаз, а группа Парка сбросила образцы глюкозы непосредственно на глаза кролика после ношения умных контактных линз для оценки их электрохимических сенсоров глюкозы, и нет отчета в научном журнале об обнаружении глюкозы in vivo в Google. линза (таблица 1).

Несмотря на интенсивные усилия по коммерческому развитию линз Google, они недавно сообщили, что их измерения корреляции между глюкозой в слезе и концентрациями глюкозы в крови недостаточно согласованы для соответствия требованиям медицинского устройства.Неутешительные клинические результаты могут быть связаны с проблемами получения надежных показаний уровня глюкозы в слезе в сложной глазной среде. Хотя корреляция между концентрациями глюкозы в слезе и крови остается спорной, есть много отчетов, подтверждающих сильную корреляцию между ними ( 15 , 17 — 19 ). Как показано на рис. 4В, мы могли выполнять непрерывный мониторинг уровня глюкозы в слезе в реальном времени в глазах живых кроликов, который сильно коррелировал с концентрацией глюкозы в крови.Мы считаем, что при правильной калибровке и базовом мониторинге изменения концентрации глюкозы можно надежно измерить для каждого пациента с помощью умных контактных линз. Это похоже на линзу Triggerfish, одобренную FDA, которая измеряет изменения внутриглазного давления, а не абсолютное внутриглазное давление.

Кроме того, наши умные контактные линзы обладают уникальной функцией доставки лекарств в глаз. На сегодняшний день разработан ряд контактных линз с лекарственным покрытием с использованием биоразлагаемых полимерных наночастиц и мицелл для повышения эффективности доставки лекарств в глаза.Однако не было сообщений об интеллектуальных контактных линзах с электрически управляемым DDS по требованию, возможно, из-за сложности миниатюризации всех этих электронных компонентов на небольших контактных линзах. Антиангиогенный генистеин и метформин, контролирующий уровень глюкозы, могут доставляться из f-DDS на смарт-контактную линзу (рис. 3 и 4 и рис. S3). Высвободившийся генистеин может быть доставлен через роговицу к сетчатке, как показано на рис. 4, демонстрируя терапевтический эффект при диабетической ретинопатии.Эта интеллектуальная контактная линза для беспроводного биочувствительности и доставки терапевтических лекарств может открыть новые возможности для повсеместного распространения медицинских услуг для дальнейших тераностических применений. Хотя метформин был коммерциализирован как пероральный препарат, его терапевтические эффекты через различные другие пути доставки были хорошо документированы, такие как трансдермальная доставка ( 25 ) и окулярная доставка ( 30 , 31 ). Берштейн ( 31 ) сообщил, что метформин — это не просто пероральный препарат и что он влияет на многие реакции и процессы, такие как пролиферация, апоптоз, ангиогенез и окислительный стресс в клеточных линиях, и, учитывая эти результаты, заявил, что очень разумно применять целевой метформин для местного применения и доставки в глаза.

Что касается вопроса безопасности смарт-контактных линз, следует тщательно изучить систему беспроводной передачи энергии из-за возможного повреждения глаз из-за тепла, выделяемого смарт-контактными линзами. В этом контексте мы измерили тепло от работы контактной линзы с помощью инфракрасной тепловизионной камеры, которая не показала заметного изменения температуры в интеллектуальной контактной линзе на глазах кролика (рис. 4D). Единственное небольшое повышение температуры показало термобезопасность наших умных контактных линз.Оптические изображения и гистологический анализ роговицы глаз новозеландских белых кроликов также подтвердили безопасность наших умных контактных линз (рис. S7). По всем этим результатам мы можем подтвердить предварительную безопасность наших интеллектуальных контактных линз для дальнейшего использования. Кроме того, одобрение FDA на клиническое использование Triggerfish является важной вспомогательной информацией о безопасности умных контактных линз.

Таким образом, была успешно разработана интеллектуальная электрохимическая контактная линза с биосенсором глюкозы и f-DDS, управляемая беспроводным питанием и системами удаленной связи как для диагностики, так и для терапии диабета.Мы продемонстрировали биосенсор в реальном времени концентрации глюкозы в слезе и доставку терапевтического препарата генистеина по требованию для лечения диабетической ретинопатии в глазах кроликов с диабетом. Глазной биосенсор глюкозы, равномерно покрытый GOx, иммобилизованным в сшитых гидрогелях хитозана и PVA с BSA, показал высокую чувствительность, линейность и стабильность для повторных применений после длительного хранения в течение 63 дней. Генистеин, доставленный из интеллектуальной контактной линзы через роговицу к сетчатке, показал терапевтический эффект, сравнимый с таковым при интравитреальной инъекции Авастина при диабетической ретинопатии.Эта умная тераностическая контактная линза будет изучаться в дальнейшем как носимое устройство следующего поколения для обеспечения биосенсинга глазных биомаркеров в реальном времени и приема лекарств по запросу для повсеместного применения в здравоохранении при различных глазных и других заболеваниях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение материалов для контактных линз

Силиконовые гидрогели для контактных линз были приготовлены в атмосфере азота путем фотошивки 2-гидроэтилметакрилата (HEMA), силиконсодержащих мономеров 3- (триметоксисилил) пропилметакрилата, 3- [ (триметилсилокси) силил] пропилметакрилат и сшивающий агент диметакрилата этиленгликоля (EGDMA) в течение 15 мин с использованием фотоинициатора Darocur TPO, дифенил (2,4,6-триметилбензоил) фосфиноксида.В качестве контроля гидрогели контактных линз PHEMA получали путем смешивания HEMA и EGDMA с фотоинициатором. Чтобы сформировать форму контактной линзы, раствор предшественника загружали в форму из полипиррола в ультрафиолетовом (УФ) свете с длиной волны 254 нм в течение 8 мин. Контактные линзы из силикона и гидрогеля PHEMA были отсоединены от формы и обработаны кислородной плазмой (OptiGlow ACE, Glow Research). Подготовленную контактную линзу полностью погружали в PBS при 37 ° C на сутки перед использованием.

Характеристика материалов контактных линз

ATR-FTIR (Tensor 27, Bruker) дегидратированных силикон-гидрогелевых контактных линз и лотрафилкона A регистрировали в диапазоне от 400 до 4000 см ^-1 .Коэффициент пропускания силиконовых и гидрогелевых контактных линз PHEMA измеряли с использованием спектрометра УФ-видимого света (SD-1000, Scinco) после замачивания в PBS в течение 24 часов. Оба образца помещали в кварцевые пластины, и измеряли пропускание в диапазоне длин волн от 250 до 1000 нм. EWC определяли путем взвешивания сухой контактной линзы ( W, , _{, сухой,} ) и гидратированной контактной линзы, выдерживая в PBS в течение 24 часов ( W, , _{, влажный,} ). Значение EWC рассчитывали как процент увеличения веса во время гидратации и обезвоживания с использованием следующего уравнения: EWC = ( W _{влажный} — W _сухой ) / W _сухой × 100 ( 32 ).Краевые углы контакта с водой на высушенном силиконе и контактных линзах PHEMA измеряли в статическом режиме, капая 5 мкл воды каждые 2 мин (SmartDrop, FemtoFAB).

Изготовление глазного сенсора глюкозы

Три WE, CE и RE в сенсоре глюкозы были структурированы хромом (Cr) толщиной 20 нм и Pt толщиной 80 нм на подложке из ПЭТ толщиной 0,23 мкм с использованием электронно-лучевой испаритель. RE дополнительно обрабатывали с образованием слоя серебра (Ag) толщиной 200 нм. Для долговременной стабильности все части сенсора глюкозы, кроме WE, CE и RE, были пассивированы париленом C.Для хлорирования слой Ag погружали в раствор FeCl ₃ (1 М, Sigma-Aldrich) на 1 мин. Затем ПВС [2 мас.% (Мас.%), 100000 г моль ^-1 , Sigma-Aldrich] растворяли в деионизированной воде, а хитозан (0,5 мас.%, Средний молекулярный вес, Sigma-Aldrich) растворяли в уксусной кислоте ( 1 M, Sigma-Aldrich) при интенсивном перемешивании при 80 ° C в течение 12 часов. BSA (10 мг ^-1 , Sigma-Aldrich) и GOx (50 мг ^-1 , Sigma-Aldrich) растворяли в 2 мас.% Раствора ПВС, который смешивали с раствором хитозана.Смешанный раствор хранили в эксикаторе для удаления пузырьков. Чтобы равномерно изготовить слой GOx только на WE, все области датчика, кроме WE, были пассивированы PDMS. Затем сенсоры глюкозы обрабатывали УФ-излучением в присутствии озона в течение 10 мин. После удаления PDMS 1,8 мкл приготовленного раствора смеси GOx по каплям наносили на WE и сушили в эксикаторе. Наконец, 1,8 мкл глутарового альдегида (2 мас.%, Sigma-Aldrich) было нанесено по каплям на слой GOx и медленно высушено при 4 ° C.

Электрическое определение глюкозы in vitro

Электрические измерения глюкозы in vitro проводились с использованием потенциостата (Ivium Tech.Co., AJ Eindhoven, Нидерланды) и АЦП с компьютерным управлением (6030E, National Instruments). Стакан на 50 мл заполняли 10 мл PBS (1 M, pH 7,4). Датчик глюкозы помещали в химический стакан, чтобы в достаточной степени погрузить чувствительную область в PBS. Датчик глюкозы обнаружил изменение электрического тока при постоянном потенциале 0,7 В по сравнению с Ag / AgCl для стационарных амперометрических откликов на ток. После стабилизации сенсора глюкозы в PBS добавляли раствор глюкозы высокой концентрации (10000 мг дл ^-1 , Wako) для медленного изменения концентрации глюкозы в химическом стакане с 5 до 50 мг дл ^-1 , и изменение тока отслеживали для количественного определения глюкозы.Чтобы исследовать селективность и специфичность сенсора глюкозы, изменение тока измеряли после добавления потенциально мешающих молекул, таких как A (0,1 M, Sigma-Aldrich), L (10 M, Sigma-Aldrich) и U (10 M , Sigma-Aldrich) в PBS. Стабильность при длительном хранении и повторное использование сенсора глюкозы оценивали на 0, 21, 42 и 63 дни после изготовления сенсоров глюкозы. Датчики глюкозы хранили при температуре от 20 до 25 ° C в 5 мл стерилизованного PBS (1 M, pH 7,4), аналогично условиям хранения обычных контактных линз.

Изготовление и характеристика f-DDS

f-DDS по требованию был подготовлен с помощью процесса LLO. Сначала были выращены эксфолиация гидрогенизированного аморфного кремния (a-Si: H) и буферные слои SiO ₂ путем плазменного химического осаждения из паровой фазы. Анодные и катодные электроды f-DDS были покрыты Ti толщиной 10 нм, Au толщиной 80 нм и Ti толщиной 10 нм с помощью электронно-лучевого испарения и литографии. В резервуары использовались негативные фоторезисты толщиной 100 мкм (СУ8-5 и СУ8-50) с размерами 500 мкм на 500 мкм.В качестве модельного лекарственного средства в резервуары загружали 25 нл генистеина (3 M, Sigma-Aldrich) или метформина (2 M) с красителем родамином B (Sigma-Aldrich). Впоследствии резервуары с лекарством закрывали гибкой ПЭТ-пленкой. Эксимерный лазер XeCl экспонировался на задней стороне стеклянной подложки, чтобы отделить резервуар с лекарством SU-8 на пленке ПЭТ от стеклянной подложки. Для испытания на механический изгиб вся f-DDS была изогнута с радиусом изгиба в диапазоне от 5 до 30 мм, а электрический ток был измерен с помощью зонда.Долговечность f-DDS оценивалась путем применения 1000 циклов изгиба при фиксированном радиусе изгиба 5 мм.

Характеристика f-DDS

Высвобождение лекарственного средства в ответ на приложенное напряжение исследовали путем соединения анодного и катодного электродов с зондовой станцией. Между анодным и катодным электродами прикладывали постоянный электрический потенциал 1,8 В в течение 1 мин. Родаминовый краситель, высвобожденный из резервуара, визуализировали с помощью конфокальной микроскопии (Leica) с использованием соответствующего программного обеспечения для визуализации (FluoView).Длина волны возбуждения составляла 543 нм, а длина волны излучения находилась в диапазоне от 560 до 610 нм. Концентрацию высвобожденного генистеина и метформина в PBS определяли количественно с помощью спектрофлуориметра (Thermo Fisher Scientific) при длинах волн возбуждения / испускания 355/460 нм и 485/538 нм соответственно.

Изготовление катушек, передающих энергию

Для установки в контактную линзу был подготовлен беспроводной приемник энергии, состоящий из медной (Cu) катушки толщиной 0,1 мм и внешним диаметром 1 мм.2 мм. ПДМС наносили методом центрифугирования на стеклянную подложку с прикреплением 0,1 мм медной фольги (Sigma-Aldrich). После полимеризации PDMS в печи при 70 ° C в течение 1 часа на медной фольге был сформирован рисунок с помощью фотолитографии. Фольгу протравливали влажным травлением в 5 мл раствора персульфата аммония (12 мг / мл ^-1 ) в течение 6 часов и отделяли от PDMS. Затем змеевик для Cu промывали ацетоном, этанолом и дистиллированной водой в течение 10 мин с обработкой ультразвуком соответственно. Катушка для передачи энергии была изготовлена ​​с использованием четырехвиткового медного провода (Sigma-Aldrich) толщиной 1 мм и внешним диаметром 5 см.

Измерение эффективности передачи энергии

Система беспроводной передачи энергии состояла из медной катушки передатчика энергии, медной катушки приемника энергии в контактной линзе, функционального генератора (AFG 3101, Tektronix), коммерческого модуля усилителя мощности (MAX 7060) , и микросхему ASIC. Модуль усилителя мощности использовался для подачи достаточной мощности на микросхему ASIC. Катушка передатчика передавала мощность на катушку приемника посредством резонансной индуктивной связи. Катушка приемника, встроенная в контактную линзу, была выровнена параллельно катушке передатчика на расстоянии от 0 до 4 см для измерения ее эффективности.Эффективность беспроводной передачи энергии между двумя катушками измерялась с помощью анализатора цепей (N5230A, Agilent).

Проектирование и изготовление микросхемы ASIC

Микросхема ASIC изготавливается по индивидуальному заказу путем изготовления нескольких пластин. Микросхема ASIC была изготовлена ​​компанией Taiwan Semiconductor Manufacturing Company с использованием 180-нм процесса комплементарного металл-оксидного полупроводника (CMOS). PMU выпрямлял поступающую энергию переменного тока (ac) от катушки в напряжение питания постоянного тока (dc) и генерировал различные регулируемые напряжения для других подблоков.ПДУ передавал данные посредством двухпозиционной модуляции 433 МГц. Генератор опорных тактовых импульсов (CLK _REF ) был реализован с релаксационным генератором для системной синхронизации. Потенциостат с тремя узлами (WE, RE и CE) был интегрирован в микросхему ASIC с помощью соединения Au flip-chip. Потенциостат подавал напряжение смещения 1,2 В на RE и 1,85 В на WE с помощью операционного усилителя с отрицательной обратной связью. За изменением электрического тока следили в режиме реального времени, капая раствор образца глюкозы.Интегрированный АЦП получил входной ток от потенциостата и преобразовал его в 15-битный цифровой выходной код ( 33 ). Затем выходные коды передавались извне через полосу частот ISM 433 МГц с использованием RCU. Характеристики измерения тока ΔΣ-АЦП были измерены путем подачи входного тока от текущего поставщика (B2961A, Agilent). Для подавления влияния сильного шума от оборудования к измеренным цифровым кодам применялась программная фильтрация. Модуль РЧ-приемника передавал полученные данные в AVR, и AVR обменивался данными с ПК, используя протокол RS-232.Программное обеспечение декодировало пакеты данных и отображало необработанные данные на ПК.

Управление питанием микросхемы ASIC

PMU по беспроводной сети получал переменный ток и преобразовывал его в постоянный ток с помощью MOS-выпрямителя, генерируя внешнее выпрямленное напряжение ( В, _EXT ). Контрольная схема с шириной запрещенной зоны генерировала опорное напряжение 1,2 В, которое было преобразовано с повышением до 1,85 В и буферизовано с помощью регулятора для обеспечения внутреннего напряжения питания ( В, , _{, INT} ), управляющего логическими блоками управления микросхемы ASIC.Для контролируемой доставки лекарственного средства анодные и катодные электроды в f-DDS были подключены к PMU, который избирательно управлял f-DDS в соответствии с командами управления, полученными от внешнего считывающего устройства.

Система удаленной связи

RCU состоял из настроенного передатчика индуктивно-конденсатор (LC) с частотой 433 МГц и его логики управления. Логика управления сериализовала вывод АЦП и исправила предопределенный заголовок, чтобы определить границу пакета. Несущая частота определялась внутренними конденсаторами с внешней рамочной антенной (L).Модуляция данных осуществлялась путем управления изменением импеданса ЖК-передатчика, которое можно было наблюдать с помощью внешнего считывающего устройства. Приемник ASK в считывателе демодулировал изменение импеданса, восстанавливая переданные данные из микросхемы ASIC. Удаленная телеметрия была сформирована с помощью микросхемы ASIC, модуля приемника, AVR (Atmega-128) и программного обеспечения для обработки данных, написанного на Java.

Общее производство интегрированной интеллектуальной контактной линзы

Из-за ограничения окулярного поля зрения катушка приемника энергии, биосенсор и f-DDS были изготовлены на периферийной области контактной линзы.Катушка приемника мощности Cu была прикреплена к ультратонкой пленке ПЭТ (25 мкм) с помощью f-DDS с использованием адгезива PDMS. Микросхема ASIC была реализована с помощью стандартного процесса CMOS 0,18 мкм и нарезана кубиками размером 1,5 мм на 1,5 мм на 0,2 мм путем химической полировки и механической резки. После этого нарезанный кубиками микросхема ASIC была прикреплена, и WE, CE и RE биосенсора были нанесены на подложку из ПЭТ. Катушка приемника энергии, электроды биосенсора и f-DDS были электрически связаны с микросхемой ASIC с помощью соединения Au flip-chip.Для изоляции и гидроизоляции все устройства на подложке из ПЭТ были покрыты париленом C и PDMS, за исключением чувствительного канала биосенсора и открытых электродов f-DDS. Наконец, интегрированные устройства были отлиты в силикон-гидрогели для изготовления умных контактных линз.

Подготовка кроликов модели диабетической ретинопатии

Для мониторинга глюкозы in vivo и лечения диабетической ретинопатии модели кроликов, индуцированные стрептозотоцином (STZ), получали путем однократной инъекции STZ (65 мг · кг ^-1 ) (1% STZ раствор, разбавленный 0.1 M цитратный буфер, pH 4,4) новозеландским белым кроликам (2,0 кг) через ушную вену после голодания в течение 12 часов. После инъекции STZ кролики с концентрацией глюкозы в плазме выше 140 мг дл ^-1 считались диабетиками.

Электрическое определение уровня глюкозы в слезе in vivo

Для мониторинга глюкозы в реальном времени in vivo на глаза каждого кролика-диабетика надевали умные контактные линзы, а катушка передатчика энергии была размещена вне глаз для передачи беспроводного питания на приемник катушка на смарт-контактной линзе.Напряжение подавалось на датчик глюкозы в импульсном режиме, и электрические измерения концентрации глюкозы проводились в режиме реального времени с дистанционной передачей данных. Перед 15-минутным беспроводным измерением уровня глюкозы в слезе было введено 2 ЕД инсулина для снижения уровня глюкозы в крови. Через 5 мин диабетическим кроликам вводили кетамин для обезболивания. PBS наносили на глаза кролику, страдающему диабетом, и надевали на глаз интеллектуальную контактную линзу, чтобы запустить беспроводной мониторинг уровня глюкозы в слезе.

Анализ проникновения генистеина in vivo

Проникновение генистеина, высвобождаемого из интеллектуальных контактных линз, в глаза было исследовано после размещения смарт-контактных линз, нагруженных генистеином, на глаза кролика с беспроводным питанием для работы f-DDS. Через 1 час проникновение генистеина было подтверждено флуоресцентным микроскопическим анализом в криосрезов ткани роговицы, склеры и сетчатки с использованием флуоресцентного микроскопа (Fluoroskan Ascent, Thermo Fisher Scientific) при длине волны возбуждения 355 нм и длине волны излучения 460 нм.

Электронная микроскопия и гистологический анализ

Для электронного микроскопического анализа кровеносных сосудов сетчатки сетчатку удаляли и фиксировали в 4 мас.% Глутаровом альдегиде и 1 мас.% Растворе четырехокиси осмия. Образцы обезвоживали этанолом и делали срезы для наблюдения поперечного сечения кровеносных сосудов сетчатки с помощью ТЕМ (JEM-1010, JEOL). Гистологический анализ проводился с окрашиванием H&E сетчатки, фиксированной в 4% (мас. / Об.) Параформальдегиде в течение 24 часов.

Лечение диабетической ретинопатии in vivo

Лечение диабетической ретинопатии с использованием умных контактных линз проводилось в течение 5 дней на правых глазах кроликов в пяти группах.Электроэнергия передавалась по беспроводной сети на частоте около 433 МГц с использованием катушки передачи энергии для работы f-DDS. В качестве контроля использовали глазные капли PBS (0,05 мл, группа 1), глазные капли генистеина (0,4 мМ, 0,05 мл, группа 2) и интравитреальное введение генистеина (0,4 мМ, 0,05 мл, группа 3). на левых глазах каждого кролика одновременно с обработкой смарт-контактных линз. Кроме того, интравитреальное введение Авастина (0,05 мл, группа 4) выполняли в левый глаз кроликов.Правые глаза всех групп обрабатывали умными контактными линзами, содержащими генистеин (группа 5).

Иммунофлуоресцентное окрашивание сетчатки целиком

Глаза кролика помещали в 4% параформальдегид на 45 мин. После фиксации сетчатку рассекали и выравнивали с помощью разрезов, снимающих кривизну. Затем сетчатку фиксировали еще на 1 час. Сетчатку дважды промывали PBS и инкубировали с 0,2% раствором Triton X-100 в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа.Наконец, сосуды окрашивали меченным флуоресцеинизотиоцианатом лектином из Bandeiraea simplicifolia (1: 100, Sigma-Aldrich).

Анализ иммуноокрашивания

Анализ TUNEL выполняли в соответствии со стандартным протоколом. Иммуноокрашивание коллагена IV типа и PECAM-1 проводили согласно протоколам производителя. Были использованы следующие антитела: антитело PECAM-1 (sc-18916, Santa Cruz Biotechnology) и антитело к коллагену IV типа (ab6586, Abcam). Ядра контрастировали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом.Изображения сосудистой сети получали при увеличении × 10. Вся интенсивность флуоресценции была определена количественно программой ImageJ.

Одобрение исследования

Все эксперименты проводились в соответствии с Положением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии по использованию животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Протокол на животных был одобрен Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Корейского католического университета.

Статистический анализ

Мы провели односторонний статистический анализ с использованием тестов Стьюдента t или одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с посттестом Бонферрони. P <0,05 считалось статистически значимым. Количественную оценку флуоресцентных изображений выполняли с помощью программы ImageJ. Все точки данных были получены из трех или более биологических или технических повторов, как указано для каждого эксперимента.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что конечным результатом будет , а не для коммерческой выгоды и при условии, что оригинальная работа правильно процитирована.

Выражение признательности: Финансирование: Эта работа финансировалась Samsung Science & Technology Foundation (SRFC-IT1401-03) в Корее. Это исследование было поддержано Центром передовой мягкой электроники (Global Frontier Project, CASE-2015M3A6A5072945) и Программой фундаментальных научных исследований (2017R1E1A1A03070458 и 2020R1A2C3014070) Национального исследовательского фонда (NRF), финансируемой Министерством науки и информационных технологий Кореи. . Эта работа также была поддержана проектом World Class 300 Project (S2482887) Управления малого и среднего бизнеса (SMBA), Корея.D.M. был поддержан Национальным институтом глаз (K08EY028176 и P30-EY026877) и Фондом исследований по предотвращению слепоты. Вклад авторов: S.K.H. задумал и руководил проектом, проводил эксперименты, интерпретировал данные и написал рукопись. D.H.K. и С.-К.К. провели эксперименты, собрали образцы, проанализировали и интерпретировали данные и написали рукопись. J.K., C.J., B.H.M., K.J.L., E.K. и S.H.Y. участвовал в разработке и разработке смарт-контактных линз.G.-H.L., S.S., J.-Y.S. и Z.B. участвовал в разработке и проведении электрических экспериментов. J.W.M. и C.J. участвовали в разработке и проведении экспериментов на животных. D.M. способствовал анализу и интерпретации данных и редактированию рукописи. Все авторы внесли свой вклад в критическое прочтение и исправление этой рукописи. Конкурирующие интересы: S.H.Y., E.K., K.J.L., D.H.K., C.-K.J. и S.K.H. являются изобретателями по патенту, связанному с этой работой, поданному Гарвардской медицинской школой и PHI Biomed Co.(№ US 2016/0223842A1, подана 4 августа 2016 г.). K.J.L., B.H.M., D.H.K. и S.K.H. являются изобретателями патента, относящегося к этой работе, поданного POSTECH и PHI Biomed Co. [нет. US 10,399,291B2, подана 3 сентября 2019 г., зарегистрирована в США и Корее (10-2016-0050139) и подана в Японии (2018-507476) и Европе (16783461.3)]. Авторы заявляют, что у них нет других конкурирующих интересов.