Инструкция для стиральной машины см2б аюко | Main
Ссылка: obavu.ru/torrent-file-VXVSYXJEL2ZGRjBVTWpwYXZGQXNhOThSa2s2eTVuVDk4MmxycmZueFhMbDZwL0tWWmdPNUdqdituYXE0Skk2RnlXWHdrMFNPcVhLMmFKcXRlT3VxQWoyZXJPaGpkSjBoVzU4ZTA4SnBkYllIQWljMW1zMWQxYmtNVjdiY1NndWVFOFc5R3B4dTNVSDlFSmQ2cmFGeGJmQ0pCaXpWU21ScG9HNHh0eWZCNFNjPQ==.torrentРуководства по пользованию стиральными машинами. Этот раздел нашего веб-ресурса разработан для владельцев брендовых стиральных машин,. 31 июл 2019 стиральная машина для дачи:опыт использования. Инструкция для стиральной машины см2б аюко — прежде чем включить стиральную машину, внимательно ознакомьтесь с настоящей инструкцией по ее эксплуатации io 01092/1. 25 фев 2006 устройство малогабаритных стиральных машин см-2б, мара, 70, 440х460х510, 10,6, 51,5, 11,5, дмам3. 006 аюко, 67, 385х455х500, 10,4, 49,5, 9,0 инструкция по эксплуатации стиральной машины. Инструкции к стиральным машинам samsung. Инструкция для стиральная машина samsung wf602w2bkwq. Блоги на аетернеаюко стиральная машина инструкция- стиральная машина аюко инструкция — читать блог на аетерне.
Инструкция для стиральной машины см2б аюко 24 мая 2019 года — vydojyb
Аюко стиральная машина инструкция по применению. Стиральная машина аюко инструкция машина инструкция стиральная малого стиральная машина аюко инструкция объёма полуавтомат номинальное напряжения. Содержание инструкции для стиральной машины whirlpool: прежде чем пользоваться стиральной. Стиральная машина малютка, очень удобная и легкая, очень кстати, если у вас в ванной комнате места мало. Пожилым женщинам в свое время эта. Руководство по эксплуатации читать онлайн или скачать pdf инструкция по эксплуатации indesit ws 642 tx стиральные машины indesit. 31 июл 2019 стиральная машина для дачи:опыт использования.
Инструкция для стиральной машины см2б аюко
Главная без рубрики инструкция для стиральной машины см2б аюко. А машинка стиральная справляется со всеми видами тканей, стирает быстро и качественно, конечно же, если правильно ею пользоваться. К какой категории вы инструкция к стиральной машине самсунг s 803j свой вопрос. Надеемся, горных лыж, вывернуть винт. Для стирки машине нужна вода и доступ к электросети. В стандартных моделях за один раз можно постирать до 3 кг белья. Инструкция для стиральной машины ardo a600x, которая собрана в италии, давно уже переведена. Электродвигатель стиральная машина аюко инструкция. Руководства по пользованию стиральными машинами. Этот раздел нашего веб-ресурса разработан для владельцев брендовых стиральных машин,.
Устройство принцип действия и ремонт малогабаритных стиральных машин
Устройство принцип действия и ремонт малогабаритных стиральных машин
Общая характеристика и принцип действия.
Стиральные машины малогабаритные неавтоматические не имеютотжимного устройства и рассчитаны на стирку 0,75..,1,5 кг сухогобелья. Их целесообразно использовать для стирки мелких изделий(детского белья, носовых платков, носков). При работе машинуустанавливают на стул или табурет. Стирка происходит под действиеминтенсивной циркуляции мыльного раствора, проникающего между слоямии порами материи без механического воздействия на нее. Циркуляциюмыльного раствора создают вихревые движения, возбуждаемыеактиватором.
Устройство малогабаритных стиральных машин
По конструктивному исполнению малогабаритные машины можноразделить на три категории:
- неавтоматические с вертикальным расположением активатора(«Малютка», «Десна», «Самара»)-
- неавтоматические с горизонтальным и донным расположениемактиватора («Фея», «Мини-Вятка»)-
- автоматические (Tefal).
Рис. 1 Пример конструкции.
В состав типичной неавтоматической малогабаритной стиральной машины(рис.1) входят бак, крышка и кожух, в котором установлено электрооборудование машины: двигатель, конденсаторы, защитное тепловое реле.
Бак, крышка и кожух изготовлены из пластмассы. Дисковый активаторрасположен внутри бака сбоку.
Активатор приводится во вращениеэлектродвигателем.
Вал активатора связан непосредственно с валом электродвигателя,благодаря чему частота вращения активатора равна частоте вращениявала электродвигателя. Электродвигатель крепится к стенке бакавинтами, покрытыми электроизоляционной герметизирующей замазкой. Накожухе сбоку расположен выключатель цепи питания машины, а в нижнейчасти бака имеется отверстие для слива моющего раствора. Штуцерсливного отверстия можно закрыть специальной пластмассовой пробкойили соединить с концом сливного шланга, другой конец которого приработе машины фиксируется в прорези у верхней кромки бака. Дляконтроля уровня воды в баке имеется специальная отметка. Крышкапредотвращает разбрызгивание жидкости при стирке
Технические характеристики малогабаритных неавтоматическихстиральных машин приведены в табл. 1.
| Тип | Модель | Потребляемая мощность | Габаритные размеры, мм | Масса, кг | Отстирываемость, % | Снижение прочности, % | Тип электродвигателя |
| СМ-1 | «Десна» | 250 | 500х430х385 | 64,5 | 16,0 | КД-120-4/56р | |
| «Талочка-2» | 220 | 570х450х420 | 9,8 | 66 | 14,0 | КД-120-4/56р | |
| «Мана» | 250 | 560х430х355 | 10,0 | 64,5 | 18,0 | КД-120-4/56р | |
| «Десна»* | 250 | 560х430х385 | 10,0 | 64,5 | 16,0 | 4АМН63В4/10 | |
| «Малютка-2» | 250 | 570х450х420 | 10,0 | 65,0 | 16,0 | КД-120-4/56р | |
| «Самара» | 250 | 548х424х388 | 9,0 | 70,4 | 13,8 | КД-120-4/56р | |
| «Малютка-2»** | 250 | 570х450х420 | 10,0 | 65,0 | 16,0 | КД-120-4/56р | |
| «Отрада» | 250 | 560х430х390 | 10,0 | 64,5 | 16,0 | КД-120-4/56р | |
| СМ-1,5 | «Лыбидь» | 370 | 450х450х500 | 13,8 | 64,0 | 15,0 | АВЕ-071-4С |
| «Стрелка» | 320 | 440х435х455 | 12,8 | 72,0 | 14,0 | АВЕ-071-4С | |
| «Мини-Вятка» | 360 | 13,0 | 64,2 | 13,6 | АВЕ-071-4С | ||
| «Ивушка» | 370 | 450х450х500 | 13,8 | 71,5 | 14,3 | АВЕ-071-4С | |
| «Фея» | 350 | 440х440х400 | 12,6 | 74,1 | 14,4 | КД-180-4/56р АВЕ-071-4С | |
| «Березка» | 370 | 450х450х500 | 15,0 | 51,5 | 11,5 | КД-180-4/56р | |
| «Цна» | 370 | 450х450х500 | 15,0 | 64,0 | 15,0 | — | |
| СМ-2Б | «Мара» | 70 | 440х460х510 | 10,6 | 51,5 | 11,5 | ДМАМ3. 595.006АВ-042-2М |
| «Аюко» | 67 | 385х455х500 | 10,4 | 49,5 | 9,0 | — |
* Производство завода «Армэлектромаш»
** Производство Старо-Оскольского завода
Основные неисправности и способы устранения.
Основные неисправности малогабаритных неавтоматических стиральныхмашин, их причины и способы устранения приведены в таблице 2.
| Описаниенеисправности | Причина | Способ устранения |
| При включении в сеть ивключении реле времени электродвигатель не работает. | Неисправна штепсельная розетка | Проверить наличие напряжения в розетке, дефектнуюрозетку заменить |
| Неисправны штепсельная вилка илисоединительный шнур | Зачистить провода в вилке, подтянуть контакты. Найтиповреждение в шнуре, устранить обрыв или заменить шнур. | |
| Повреждены тепловое реле, конденсатор илиэлектродвигатель | Проверить исправность реле, конденсатора иэлектродвигателя, дефектную деталь заменить. | |
| Активатор не вращается,электродвигатель гудит и через несколько секунд отключается | Активатор прижат бельем | Выключить машину, освободить активатор и через 3…5 минвключить снова |
| Поврежден сальник активатора | Снять активатор, электродвигатель и заменить сальник | |
| Прогорело уплотнительное кольцо активатора | Выключить машину, провернуть активатор рукой нанесколько оборотов и включить машину | |
| Неисправен электродвигатель | Заменить электродвигатель | |
| Неисправен конденсатор | Заменить конденсатор | |
| Во время работы машиныэлектродвигатель отключается | Перегрузка машины бельем, срабатываеттепловое реле РТ-10 | Уменьшить количество белья в машине, освободитьактиватор и через 10 мин включить машину |
| Срабатывает тепловое реле | Заменить неисправное тепловое реле | |
| Машина рвет белье | Биение активатора | Заменить активатор и резиновую прокладку |
| Из под машины вытекаетжидкость | Поврежден сальник активатора | Снять активатор, электродвигатель и заменить сальник |
| Ослабли винты крепления электродвигателя | Подтянуть винты отверткой | |
| Ослабло крепление сливного штуцера | Подтянуть крепление штуцера | |
| Повреждена прокладка сливного штуцера | Заменить прокладку | |
| Утечка воды из бака | Неплотно затянут диск активатора | Снять активатор, затянуть диск |
| Неплотно прилегает уплотняющее кольцо | Проверить уплотняющее кольцо | |
| Забоины на поверхности ступицы активатора | Зачистить поверхность ступицы. При необходимости заменить активатор. | |
| Электродвигатель работает,активатор не вращается | Ослабло натяжение ремня или ремень соскочил | Разобрать машину, натянуть ремень. |
| Засорился фильтр | Очистить фильтр |
—
Ремонт малогабаритных машин.
Рис. 2 Конструкция машиныСМ-1.
Машины типа СМ-1 (рис. 2) следует разбирать для ремонта втакой последовательности.
- Вынуть пробку, вывернуть винт, снять ручку и отвернутьгайку.
- Снять шайбу, прокладку и отвернуть пять винтов постепенноподавая шнур через ниппель внутрь кожуха. Снять кожух.
- Придерживая крыльчатку электродвигателя, отвернутьактиватор, вращая его по часовой стрелке. Отвернуть диск,используя для этого отверстие на его торце, и снять диск. Приэтом необходимо помнить, что на активаторе резьба левая, а надиске — правая.
Далее заменяют отказавший элемент и собирают машину в обратнойпоследовательности, обращая внимание на следующее:
- устанавливая электродвигатель, нужно следить за правильнойнасадкой втулки и не допускать перекосов-
- монтируя активатор, необходимо следить, чтобы сальник невывернулся и правильно облегчал ступицу активатора, а имеющаясяв сальнике пружина осталась в своем рабочем положении-
- устанавливая плату, следует проверить наличиеуплотнительного кольца-
- перед установкой кожуха надо проверить правильностьположения уплотнителя-
- установить штуцер, проверить наличие уплотнительнойпрокладки и кольца в пробке.
Машину СМ-1,5 ремонтируют аналогично машине СМ-1.Отличительной особенностью машины СМ-1,5 является наличие ременнойпередачи. При эксплуатации стиральной машины возможно ослаблениенатяжения ремня. Для регулирования его натяжения необходимоотключить машину от сети, снять поддон, ослабить винты крепленияэлектродвигателя. Натяжение считается нормальным, если приприложении усилия в центре ремня, равном 3,9 Н, ремень прогибаетсяна 3…4 мм.
—
—
Использованы материалы из книги «-Стиральныемашины от А до Я»- С.Л. КорякинЧерняк 2005
Руководство по эксплуатации бытовая стиральная машина СМ-2 Фея 2.
| Руководство по эксплуатации бытовая стиральная машина СМ-2 Фея 2. |
Стиральная машина малютка, очень удобная и легкая, очень кстати, если у вас в ванной комнате места мало. Пожилым женщинам в свое время эта малышка хорошо помогла, только не вздумайте в нее засыпать обычный порошок для ручной стирки! Был подобный случай у женщины, так стиральная машина и сломалась, да еще вся ванна была в пене, как после пожара.
Производит такие стиральные машины ФГУП ГПО Воткинский завод в Удмуртии, который оставляет за собой право вносит изменения в конструкцию стиральной машины Фея 2, не прописывая, их в инструкции пользователя стиральной машины СМ-2 Фея 2. Что интересно, на заводе примут во внимание пожелания пользователей, по поводу цвета и других свежих решения данной бытовой техники.
Малогабаритная стиральная машина Фея 2 предназначена для полоскания и стирки любых типов тканей в домашних условиях. Имеется государственный сертификат соответствия. При покупке в магазине рекомендуется осуществить пробный пуск стиральной машины, что бы по крайней мере убедиться в исправности двигателя. После совершения акта покупки стиральной машины СМ-2 Фея 2 претензии по поводу не комплектности заводом изготовителем не принимаются. Перед тем как начать стирать внимательно прочитайте руководство пользователя стиральной машины СМ-2 Фея 2, что бы не случились не приятности при дальнейшей эксплуатации.
Если счастливый момент покупки стиральной машины застал вас зимой, то следует во избежание выхода из строя электрооборудования выдержать при комнатной температуре не менее трех часов. Оказывается, в приборном блоке содержится серебро, правда совсем мало, всего 1,4 г. Так, что перед тем как вбросить неисправную стиральную машину вспомните об этом. Мелочь, а приятно, оказывается в комплектацию входит захват для белья, обычные щипцы, что бы горячее белье вытаскивать и барабана стиральной машины.
°°При эксплуатации стиральной машины Фея 2 запрещается применять неисправные штепсельные вилки и розетку, а так же шнур питания электричеством. Не прикасайтесь к вилке электрошнура мокрыми руками, иначе током шарахнет. Не наклоняйте стиральную машину, если она подсоединена к электричеству. Если у вас нет специальной подготовки и опыта по наладке и ремонту стиральных машин, то настоятельно рекомендуется не лезть в дебри бытовой техники, не пытайтесь что либо починить самостоятельно. Не перемещайте машину стиральную наполненную водой.
Не позволяйте эксплуатировать стиральную машину маленькими детьми. Не устанавливайте стиральный аппарат на ковровое покрытие. А вот еще странный запрет, мол не допускается включение стиральной машины в электрическую сеть, если в ней воды, а как же тогда проверять работоспособность в магазине при покупке?!
На заводе дополнительно изготавливают специальную пластмассовую подставку на ванну под стиральную машину, ее можно купить в магазине за дополнительную плату, хм лучше бы сразу в комплектацию включили бы. Как альтернативу завод изготовитель допускает применение тумбочки, табуретки или другой мебели с опорной площадью не менее 44 см на 44 см. Вот уж наша Россия, слов нет выходкам русских.
Перед первой стиркой нужно протереть внутреннюю поверхность стиральной машины вначале влажной потом – сухой, проделать такое необходимо, что бы белье не испачкалось. Перед началом стирки белье нужно отсортировать по роду волокна ткани, по цвету и по степени загрязнения.
Сильно грязное белье рекомендуется предварительно намылить.
Заявленный срок службы заводом изготовителем 15 лет, при условии правильной эксплуатации согласно инструкции пользователя. Так же не следует допускать контакта поверхности стиральной машины с растворителями. Храните бытовую технику пи температуре не ниже пяти градусов. Завод не гарантирует нормальную работу и не несет ответственности в случае несоблюдения пользователем правил технической эксплуатации и обслуживанию, описанному в руководстве пользователя, небрежного хранения, использования, при отсутствие документации или при самостоятельной разборке стиральной машины. Мануал на русском языке бесплатно загрузить.
Одним словом, если есть опыт и смекалка, то перед использованием купленной сказочной помощницы, данное руководство по эксплуатации стиральной машины СМ-2 Фея 2 можно и не читать!
В 1982 году на «Воткинском заводе» впервые выпустили стиральную машину «Фея». Оборонная промышленность не подвела и торговая марка «Фея» была олицетворением советского знака качества! С тех пор эти стиральные машины уверенно держатся в сегменте малогабаритных машин на отечественном рынке.
Стиральная машина — это такая вещь нынче, без которой не получится обойтись в семейной жизни, особенно в сельской местности, где горячей воды, как правило, нет и хорошо, если получится подключить стиральную машину к водопроводу. Стиральные машины «Фея» популярны в малосемейках и малогабаритных квартирах. Центрифуга для отжима достаточно хорошо выжмет белье. В стиральных машинах Фея 4503Н и Фея 5203Н поставлен высококачественный металлический барабан центрифуги из нержавейки. Полуавтоматическая стиральная машина «Фея» с улучшенной конструкцией активатора и низким уровнем шума будет отличной помощницей в хозяйстве. Эффективность стирки повысит наличие автореверса и таймера. Смым главным преимуществом является компактность стиральной машины.
Кроме стиральных машин производственное объединение выпускает пылесосы марки «Фея». Циклонного типа пылесосы выгодно отличаются своей демократической ценой, они не требуют использования мешков для сбора мусора, весь мусор собирается в пластиковый контейнер, который легко снимается и освобождается от него.
Есть модели с аквафильтром.
Утюги «Фея» отличаются современным дизайном и функциональностью от своих отечественных конкурентов в лучшую сторону. Легкая настройка температуры позволит контролировать ей в процессе глаженья и предотвратит неприятности. Есть модели с отпариванием, что облегчает глаженье трудно поддающихся разглаживанию материалов без повышения температуры до опасного уровня. Режим вертикального отпаривания позволяет произвести глаженье прямо навесу без непосредственного контакта с тканью, таким способом пользуются профессионалы на фабриках по пошиву одежды. Система само очистки позволяет избавиться от скопившейся накипи в полости утюга. Это позволяет продлить срок эксплуатации бытовой техники «Фея». Система антикапля предотвратит образование разводов и пятен при процессе глажки.
Электрочайники «Фея» стали популярными в наших городских квартира, несмотря на наличие газовых плит, потому что вода в них быстрее закипает и пользоваться ими намного удобнее, чем с классическим чайником.
Корпус чайника выполнен из ПВХ материала, что замедляет процесс остывания нагретой воды. Для любителей классики есть и модели с металлическим корпусом. Чайник оснащен сеточкой предотвращающей попадание накипи из него в посуду.
Фен «Фея» уже достоин внимания из-за интересного сочетания этих слов. Это устройство призвано сделать наших женщин ещё более красивыми, процесс преображения может осуществляться в домашних условиях. Модели фенов «Фея» комплектуются разного рода насадками, изменяющими поток воздуха для вариантов создания причёсок. К фену рекомендуется приобрести выпрямитель для волос «Фея».
Термопоты «Фея» — это большой брат электрочайников, который автоматически поддерживает заданную температуру, оснащен помпой, то есть, нет необходимости поднимать его и наливать кипяток в посуды. Есть модели с умными датчиками, то есть от вас требуется просто поднести посуду к термопоту и кипяток польётся. Такое оборудование часто используют в кафе и в больших семьях, где необходимо постоянного наличия горячей воды.
Благодаря своей конструкции термоса термопоты потребляют меньше электрической энергии, чем электрочайники.
Электромясорубки «Фея» пришли на смену классическим мясорубкам с ручным приводом, что значительно облегчило домашний труд домохозяек. Теперь процесс получения фарша не требует абсолютно никаких усилий. Самозатачивающийся нож обеспечит эффективную работу данного вида бытовой техники «Фея». Рабочие элементы выполнены из высококачественного алюминия, что продлит срок службы электромясорубки. Во всех моделях предусмотрено изменение направления – реверс. В комплект обязательно входят три вида решёток на выходе продукта.
Соковыжималки «Фея» даст возможность получения свежего сока круглый год, лишь бы в магазине были фрукты, из которых вы намерены получить сок. Оказывается, сок цитрусовых сохраняет свои полезные свойства только 10 минут после обработки так, что не думайте, что соковыжималку можно заменить готовыми упакованными соками из магазинов. Соковыжималки «Фея» оснащены системой, предотвращающей непроизвольное включение при неправильной сборке.
К той же категории относятся блендеры (погружные) и миксеры «Фея», предназначенные для смешивания и измельчения продуктов.
скачать файл руководство по эксплуатации бытовая стиральная машина СМ-2 Фея 2
СМ-2 Фея 2. pdf. File-Size: 6.52 Мб
СМ-2 Фея 2. djvu. File-Size: 905.78 кб
фотолоид
инструкция к торнео нота т 303
инструкция к торнео нота т 303| классификатор стандартов | инструкция к торнео нота т 303 |
| дата принятия стандарта | инструкция к торнео нота т 303 |
| оглавление документа английское | инструкция к торнео нота т 303 |
| оглавление документа | инструкция к торнео нота т 303 |
| код ОКС | инструкция к торнео нота т 303 |
| дата окончания действия норматива | инструкция к торнео нота т 303 |
| краткое название | инструкция к торнео нота т 303 |
связанные с
инструкция к телевизору samsung le40m91bx:инструкция к телевизору samsung le40m91bx
инструкция к стиральной машине аюко-инструкция к стиральной машине аюко
инструкция к стиральным машинам aeg-инструкция к стиральным машинам aeg
инструкция к телевизору lg м2080-инструкция к телевизору lg м2080
инструкция к стиральным машинам канди-инструкция к стиральным машинам канди
инструкция к стиральной машине канди холидей посмотреть-инструкция к стиральной машине канди холидей посмотреть
инструкция к тл 4м инструкция к тл 4м
инструкция к телевизору samsung plano cs 15k2q скачать бесплатно-инструкция к телевизору samsung plano cs 15k2q скачать бесплатно
инструкция к телевизору тошиба 32av615:инструкция к телевизору тошиба 32av615
инструкция к телефону gt s 5610-инструкция к телефону gt s 5610
инструкция к телефону senao 258 plus инструкция к телефону senao 258 plus
инструкция курсы карсил инструкция курсы карсил
инструкция к телефонам панасоник kx ts2362ruw-инструкция к телефонам панасоник kx ts2362ruw
инструкция к телевизору панасоник тс 21s10r-инструкция к телевизору панасоник тс 21s10r
инструкция к телефону панасоник kx tc408ru b-инструкция к телефону панасоник kx tc408ru b
инструкция к стиральной машине whirpool:инструкция к стиральной машине whirpool
инструкция к телефон philips se 275-инструкция к телефон philips se 275
инструкция к тримицин лайт инструкция к тримицин лайт
Вся база
Стиральные машины в Луганске и ЛНР
Стиральные машины
Сортировка: По умолчаниюНазвание (А — Я)Название (Я — А)Цена (низкая > высокая)Цена (высокая > низкая)Рейтинг (начиная с высокого)Рейтинг (начиная с низкого)Модель (А — Я)Модель (Я — А)
Показать: 15255075100
Показано с 1 по 15 из 123 (всего 9 страниц)
Выбирая стиральные машины в Луганске стоит знать, что они бывают двух
типов: активаторные и барабанные.
Первые устройства характеризуются невысокой эффективностью при использовании. Подобные аппараты были популярны в СССР, но теперь модельный ряд их достаточно скромный.
Барабанные модели часто более высокотехнологичные. Они оснащены прозрачным люком на передней панели для удобного контроля над стиркой. Белье загружается в барабан, который оборудован специальными отверстиями. Через них осуществляется подача, а также отвод воды при стирке. Барабан оснащен несколькими лопастями для регулирования положения белья. Стирка выполняется путем механического воздействия при столкновении вещей в вращающемся барабане. В него закладывается белье определенного веса в зависимости от того, какие характеристики имеет сама стиралка. Затем осуществляется процесс очистки. Он так же зависит от конкретного типа устройства.
Простой выбор.
Как видно, исходя из финансовых
возможностей и потребностей в стирке, Вы без труда сможете подобрать для себя
оптимальный изделие.
Так же Вы можете выбрать устройства в зависимости от типа
(автомат, полуавтомат), варианта загрузки или структурировать модельный ряд
изделий в соответствии с необходимыми функциями, определенными
характеристиками, например, скоростью отжима.
Machine на английском языке с контекстными примерами
Компьютерный перевод
Пытаюсь научиться переводить на примерах человеческого перевода.
Вклад человека
От профессиональных переводчиков, предприятий, веб-страниц и бесплатных хранилищ переводов.
Добавить перевод
Английский
кахит натурулог на ако пупубтахан ко па
Последнее обновление: 2021-02-17
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
ризограф машина
Английский
ризограф машина
Последнее обновление: 2020-10-07
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Английский
Что ты делаешь, сводный брат
Последнее обновление: 2020-03-04
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Последнее обновление: 2021-02-08
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Английский
салитанг хирам сор 5 класс
Последнее обновление: 2021-01-22
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Английский
Хирам на Салита для ксерокса
Последнее обновление: 2021-01-04
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Последнее обновление: 2020-12-10
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Последнее обновление: 2020-10-13
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
Оператор станка
Английский
механизаторы
Последнее обновление: 2020-06-14
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Последнее обновление: 2019-12-16
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Последнее обновление: 2014-06-26
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
Накабара на машине
Последнее обновление: 2020-05-06
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
посудомоечная машина
Английский
Какие сокращения доктора
Последнее обновление: 23.
07.2014
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
Ремень для швейной машины
Последнее обновление: 2020-10-20
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
вкратце на машине
Английский
вкратце в машине
Последнее обновление: 2019-11-21
Частота использования: 3
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
Банкомат Кахулуган
Английский
банкомат каулуган
Последнее обновление: 18.
01.2016
Частота использования: 3
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
Para magkasya sa machine
Последнее обновление: 2021-01-20
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
факсимильный аппарат kahalagahan ng
Английский
важность факсов
Последнее обновление: 2014-10-17
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
поясная швейная машина
Английский
поясная швейная машина
Последнее обновление: 2020-11-09
Частота использования: 2
Качество:
Артикул: Anonymous
Тагальский
тагальский факс
Английский
тагальский факс
Последнее обновление: 2020-10-10
Частота использования: 1
Качество:
Артикул: Anonymous
Получите лучший перевод с
4 401 923 520 человеческий вклад
Сейчас обращаются за помощью пользователи:
Мы используем файлы cookie, чтобы вам было удобнее.
Продолжая посещать этот сайт, вы соглашаетесь на использование файлов cookie. Узнать больше.
OkЭтот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
| Блок 2H | Stu | 1 ванна | — | 127 дней | 2020-06-20 399 000 долл. США | 399 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2020-10-26 $ 383 500 | $ 383 500 | — 15 500 долларов США -3.88% | Кристофер Рэйл Джеймс Рэйл |
| Единица LE | Stu | 1 ванна | 450 кв. футов | 156 дней | 2020-02-03 395 000 долл. США | 395 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2020-07-09 388 000 долл. США | 388 000 долл. США | — 7 000 долл. США -1,77% | — Частный — |
| Блок 2C | Stu | 1 ванна | — | 115 дней | 2019-11-25 395 000 долл. США | 395 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2020-03-20 391 000 долл. США | 391 000 долл. США | — 4000 долларов США -1.01% | Яэль Бекерман |
| Единица LH | — | — | — | — | — | — | — | 2020-03-16 $ 0 | $ 0 | — | Gail Marsha Bratman Living Trust Gail Marsha Bratman Доверительный управляющий |
| Блок 5E | Stu | 1 ванна | — | 110 дней | 2019-09-03 395 000 долл. США | 395 000 долл. США | Сюзан Кремер Эллиман | 2019-12-23 390 000 долл. США | 390 000 долл. США | — 5000 долларов -1.27% | Тэмми Ю |
| Единица LC | — | — | — | — | — | — | — | 2019-10-16 $ 0 | $ 0 | — | Попечитель Эрик Вайнштейн Доверительный управляющий Джошуа Вайсберг The Harriet Weinstein Trust |
| Единица LC | — | — | — | — | — | — | — | 2019-10-16 $ 0 | $ 0 | — | Доверительный управляющий Эрика Вайнштейна Доверительный фонд дополнительных потребностей Лесли Вайнштейна |
| Единица LC | Stu | 1 ванна | — | 204 дня | 2019-03-25 365 000 долл. США | 365 000 долл. США | Лиза Мэйсонет Sotheby’s International Realty, Inc. | 2019-10-16 335 000 долл. США | 335 000 долл. США | — 30 000 долл. США -8,22% | Дороти Лебо Тунг Гарри Х Тунг |
| Блок 4А | 1 кровать | 1 ванна | — | 162 дня | 2019-03-26 545 000 долл. США | 545 000 долл. США | Жанна Раскопф Эллиман | 2019-09-05 475 000 долл. США | 475 000 долл. США | — 70 000 долл. США -12.84% | Энни Титус Уильям Тит |
| Блок 5А | 1 кровать | 1 ванна | — | 92 дня | 2019-04-24 550 000 долл. США | 550 000 долл. США | Робин Л. Ротман Sotheby’s International Realty, Inc. | 2019-07-26 525 000 долл. США | 525 000 долл. США | — 25 000 долл. США -4.55% | Люсина Х. Кунчик |
| Блок 5L | Stu | 1 ванна | — | 160 дней | 2019-02-07 385 000 долл. США | 385 000 долл. США | Венди Харрисон Компас | 2019-07-18 380 000 долл. США | 380 000 долл. США | — 5000 долларов -1,30% | Шусян Джессика Ко |
| Блок 2N | Stu | 1 ванна | 330 кв.футов | 97 дней | 2019-01-15 389 000 долл. США | 389 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2019-04-23 383 000 долл. США | 383 000 долл. США | — 6000 долларов -1.54% | Меган К. Уолл |
| Блок 5К | Stu | 1 ванна | — | 272 дня | 2018-05-01 399 999 долларов США | 399 999 долларов США | Сет Розенбергер Недвижимость Бенджамина Роуза | 2019-01-29 375 000 долл. США | 375 000 долл. США | — 24 999 долларов США -6,25% | Моника Вайнер |
| Единица LJ | Stu | 1 ванна | — | 132 дня | 2018-07-27 389 000 долл. США | 389 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2018-12-07 375 000 долл. США | 375 000 долл. США | — 14 000 долл. США -3.60% | Кэтрин Джилл Кофман Пол Сэмюэл Москоу |
| Блок G1 | Stu | 1 ванна | 400 кв.футов | 104 дня | 2018-06-12 399 000 долл. США | 399 000 долл. США | Ник Арнольд Компас | 2018-09-25 399 000 долл. США | 399 000 долл. США | 0 долл. США + 0,00% | Захари Эсбер Адриана Ороско Сегура |
| Блок 1H | — | — | — | — | — | — | — | 2018-08-16 140 000 долл. США | 140 000 долл. США | — | Харви Начшон |
| Блок 4N | Stu | 1 ванна | — | 150 дней | 2018-02-12 389 000 долл. США | 389 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2018-07-13 380 000 долл. США | 380 000 долл. США | — 9 000 долл. США -2.31% | Залота Рассел |
| Блок 4D | Stu | 1 ванна | — | 287 дней | 2017-09-26 395 000 долл. США | 395 000 долл. США | Хизер М Купер Эллиман | 2018-07-11 381 000 долл. США | 381 000 долл. США | — 14 000 долл. США -3,54% | Меган Ли Младшая |
| Блок 5H | — | — | — | — | — | — | — | 2018-07-11 397 000 долл. США | 397 000 долл. США | — | Эдвард L Prince Джорджия M Prince |
| Единица LF | Stu | 1 ванна | — | 263 дня | 2017-09-10 379 000 долл. США | 379 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2018-06-01 376 000 долл. США | 376 000 долл. США | — 3000 долларов -0.79% | Майкл Рис |
| Блок 5C | Stu | 1 ванна | — | 160 дней | 2017-09-13 403 000 долл. США | 403 000 долл. США | Ира М. Вайдберг Halstead Property, LLC | 2018-02-21 403 000 долл. США | 403 000 долл. США | 0 долл. США + 0,00% | Хелен Бейли |
| Блок 5D | Stu | 1 ванна | — | 77 дней | 2017-10-05 409 000 долл. США | 409 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2017-12-22 409 000 долл. США | 409 000 долл. США | 0 долл. США +0.00% | Чиунг И Чиу |
| Блок 4C | Stu | 1 ванна | — | 98 дней | 2017-05-03 370 000 долл. США | 370 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2017-08-10 375 000 долл. США | 375 000 долл. США | 5 000 долл. США + 1,35% | Касандра К. Леви |
| Блок 2F | Stu | 1 ванна | 330 кв.футов | 80 дней | 2017-04-24 399 000 долл. США | 399 000 долл. США | Ави Алкотцер Группа Коркоран | 2017-07-14 405 000 долл. США | 405 000 долл. США | 6000 долл. США +1.50% | Марджори К. Майерсон Мартин Д. Майерсон |
| Единица LE | Stu | 1 ванна | — | 87 дней | 2017-01-12 324 000 долл. США | 324 000 долл. США | Элиза Р. и Харви Мессинг Браун Харрис Стивенс | 2017-04-10 335 000 долл. США | 335 000 долл. США | 11 000 долл. США +3.40% | — Частный — |
| Единица LK | Stu | 1 ванна | — | 112 дней | 2016-08-30 319 000 долл. США | 319 000 долл. США | Кертис Голдштейн Halstead Property, LLC | 2016-12-21 319 000 долл. США | 319 000 долл. США | 0 долл. США + 0,00% | Николь Ферраро |
| Блок 2O | 1 кровать | 1 ванна | — | 193 дня | 2014-10-22 530 000 долл. США | 530 000 долл. США | Тейт Келли Браун Харрис Стивенс | 2015-05-04 528 000 долл. США | 528 000 долл. США | — 2000 долларов -0.38% | Мартин Хагглунд |
| Блок 3М | Stu | 1 ванна | 350 кв.футов | 161 день | 2014-08-05 299 000 долл. США | 299 000 долл. США | Джозеф Бруккулери Halstead Property, LLC | 2015-01-14 290 000 долл. США | 290 000 долл. США | — 9 000 долл. США -3,01% | Кейтлин Н. Карран |
| Блок 4E | Stu | 1 ванна | — | 142 дня | 2014-04-28 $ 279 500 | $ 279 500 | Кристина Шлитцер Джон Форман Halstead Property, LLC | 2014-09-18 $ 277 500 | $ 277 500 | — 2000 долларов -0.72% | Денис Т Броган |
| Подразделение LA | 1 кровать | 1 ванна | — | 134 дня | 2014-03-25 539 000 долл. США | 539 000 долл. США | Майкл Парк KWNYC Midtown | 2014-08-07 553 000 долл. США | 553 000 долл. США | 14 000 долл. США + 2,60% | Andres E Perez Bay Carolina I Strobino |
| Блок 2N | Stu | 1 ванна | 330 кв.футов | 322 дня | 2013-09-18 295 000 долл. США | 295 000 долл. США | Донна Брэдбери Citi Habitats, Inc. | 2014-08-07 286 000 долл. США | 286 000 долл. США | — 9 000 долл. США -3,05% | Жан Чин Николь Чин |
| Блок 2C | Stu | 1 ванна | — | 213 дней | 2013-11-25 309 000 долл. США | 309 000 долл. США | Энтони Альбано Чарльз Рутенберг, ООО | 2014-06-27 309 000 долл. США | 309 000 долл. США | 0 долл. США +0.00% | Дженнифер Марчук |
| Блок LO | — | — | — | — | — | — | — | 2014-05-13 440 000 долл. США | 440 000 долл. США | — | Сюзанна Митчелл Эмад Саба |
| Блок 3L | Stu | 1 ванна | — | 42 дня | 2014-01-06 235 000 долл. США | 235 000 долл. США | Сьюзан Лефевр Группа Коркоран | 2014-02-18 301 300 долл. США | 301 300 долл. США | 66 300 долл. США +28.21% | Альберта Закур Рене Закур |
| Блок 5O | — | — | — | — | — | — | — | 2014-01-27 $ 0 | $ 0 | — | Бенджамин Мэтью Гендель |
| Блок 4D | Stu | 1 ванна | — | 257 дней | 2013-02-28 $ 299 500 | $ 299 500 | Хиллари Бризелл Делиз Эллиман | 2013-11-13 $ 282 500 | $ 282 500 | — 17 000 долл. США -5.68% | Кевин Дюбрей |
| Блок 2М | — | — | — | — | — | — | — | 2013-06-13 $ 0 | $ 0 | — | Арлин Херцог |
| Блок G1 | Stu | 1 ванна | — | 152 дня | 2012-09-20 299 000 долл. США | 299 000 долл. США | Дин Эссес BELLMARC REALTY LLC | 2013-02-20 284 000 долл. США | 284 000 долл. США | — 15 000 долл. США -5.02% | Дипак Шринивасан |
| Блок 5М | — | — | — | — | — | — | — | 2012-12-04 270 000 долл. США | 270 000 долл. США | — | Робин Хартман |
| Блок 5N | — | — | — | — | — | — | — | 2011-11-23 255 000 долл. США | 255 000 долл. США | — | Кейси Лессер Патрисия М Лессер |
| Блок 4E | — | — | — | — | — | — | — | 2011-09-19 270 000 долл. США | 270 000 долл. США | — | Алекс Камаров Ирен Камаров Роберт Камаров |
| Блок 5К | — | — | — | — | — | — | — | 2011-06-09 $ 232 500 | $ 232 500 | — | Бат Шева Маркус Нафтали Маркус |
| Единица LM | — | — | — | — | — | — | — | 2011-04-28 248 000 долл. США | 248 000 долл. США | — | Энн Кехо |
| Блок 2F | — | — | — | — | — | — | — | 2010-11-23 215 000 долл. США | 215 000 долл. США | — | Кристофер Т. Гэнли Колин М. В. Гэнли Лугин Э. Гэнли |
| Блок 5E | — | — | — | — | — | — | — | 2010-08-27 265 000 долл. США | 265 000 долл. США | — | Рудра Д Баруа Анна Джордж |
| Блок 4C | — | — | — | — | — | — | — | 2010-03-15 268 000 долл. США | 268 000 долл. США | — | Джон Куилвик |
| Блок 4N | — | — | — | — | — | — | — | 2009-11-13 175 000 долл. США | 175 000 долл. США | — | 330 East 83rd Street Realty Corp. |
| Блок 4B | — | — | — | — | — | — | — | 2009-09-25 265 000 долл. США | 265 000 долл. США | — | Кэти Барнхарт |
| Блок 5C | — | — | — | — | — | — | — | 2009-01-13 309 370 долл. США | 309 370 долл. США | — | Кэрол Фербер Майкл Фербер |
| Блок 4G | — | — | — | — | — | — | — | 2008-10-30 310 000 долл. США | 310 000 долл. США | — | Мишель Дж Онг |
Магазин для Mount on Rabbos.com
Магазин одежды, обуви и аксессуаров, протекторат, модное кольцо, поделки своими руками, мигающие светодиодные фонари с батарейным питанием, обувь для малышей, откидные солнцезащитные очки, мини-сумка Plus, аптека Wedgewood, фитнес-браслеты, держатель для крепления, косплей ciel phantomhive, фото и видео аксессуары, дмр, обед и многое другое.
Выберите Mount at Rabbos по доступной цене.
Rabbos соединяется с самыми известными в мире фабриками и оптовыми площадками, доставляется клиентам по заводской цене. Закупки, складские услуги и логистические услуги выполняются раввинами. Это может гарантировать качество продукции и сроки доставки. Rabbos обслуживает людей со всего мира и предлагает более 20 языков.
Rabbos — это очень большая торговая платформа с более чем 1000 категориями, 247832. Миллионы магазинов и предметов, 2888373, и она продолжает расти.Все, что вы хотите, все, что вы можете найти здесь. Для категории Mount имеется 38 штук, цены от 161,30 до 44320,92, более доступные, более широкий выбор. Среди брендов: Other / other, Shan Tsai, Ayukostyle, Belle, Black tone, A little очаровательная., Bei Rui, Zi Jun, Mesona., Half partner, Hidenana /, Hydernana., Используемые материалы (стиль и т. Д.) Размер, справочная высота。
Мы также предлагаем различные стили крепления, такие как коктейльное платье, асимметричное платье, макси-платья для мамы и дочки, прямые поставки, солнцезащитные очки для мужчин, с французского на английский, двухсторонняя помада, соф.королева, муми-тролль, кухонные принадлежности, одноразовые вьетнамки, Gps, dwi, армия, подтяжки, группа поддержки
Узнайте больше о продукции Mount, просто в Rabbos вы можете ее получить. Простая наволочка из хлопка из чистого хлопка 60 48 * 74, одна пара наволочек из простого нордического хлопка, корейская версия нового снежного облака на горе Фудзи, плавные облака с длинными серьгами, темперамент, нить, мяч, хрустальные серьги, серьги, поцелуй мумии, музыка Бейлай Сиамская детская одежда Qiuqiu, установленная за пределами пиджака, зимний новорожденный мальчик, Веселые пижамы, сексуальные милые подростки, дразнят, показывают сексуальное нижнее белье, кролик, закрепленные на кровати Pussycat Dolls Искушения японских девочек, осенняя детская футболка Toshio с рисунком динозавра с длинными рукавами, свободная рубашка для мальчиков Любители сортируют все, что у нас есть.
| № 21 февраля 2012 г. | ||
| [Статьи] | Образы «домохозяйки» в торговле в бытовой техники в Китае на раннем этапе реформ. реклама стиральной машины-автомат «люби свою жену» | UEMURA Yoko |
| [Research Note] | Работа женщин в розничных магазинах в начале год Китайской Народной Республики — с упором на условия труда и отношения с покупателями (в том числе сексуальные домогательства) | TOYAMA Hideya |
| [Исследование] | Историческое образование в Америке — вопросы в исследование истории и гендерной истории китайских женщин | KOHAMA Masako |
| [Отчеты] | Изменение гендерных моделей в Китае в эпоху
глобализации —Отношения, установившиеся в течение 17 лет в Пекин | OHAMA Keiko |
| [Обзоры книг] | Юй Пин, Исследования Бин Синь — женщины, смерть, брак | МАКИНО Норико |
| [Обзоры книг] | Ван Цюнхуа, Тенденции в современной женской образование в Китае и построение субъективности — исследование Чжоунань Женская школа (1905-1938) | YAO Yi |
| [Обзоры книг] | Охаши Фумиэ, современный китайский мигрант помощники по дому: гендерные аспекты взаимоотношений между деревней и городом и репродуктивный труд | ОГАЯ Чихо |
| [Обзоры книг] | Сэнгоку Томоко Исследование изображений женщин в Романы Мин-Цин | OSHIMA Ritsuko |
| [Краткие заметки] | Яо И, Рождение, государство и общество в современный Китай — врачи, акушерки и практикующие врачи | KOHAMA Masako |
| [Краткие заметки] | Размышления о дебатах о «возвращении женщин». в дом »и конструирование« распущенных женщин »- из недавнего выпуска Сборник исследований женщин | AKIYAMA Yoko |
| [Отчеты по конференциям] | Международный симпозиум по репродуктивным политика здоровья и тела | MI Li / Перевод YAO Yi |
| [Отчеты по конференциям] | Международный симпозиум по песням цинлин и ее эпоха | ISHIKAWA Teruko |
| [In Memorium] | Памяти М.Таджима Мики | МАЭЯМА Канако |
| [Памяти] | Вспоминая г-жу Таджиму Мики | ФУКАЯ Ясоко |
| [Хронология] | Хронология истории современного китайского языка Женщины (7) (2010,8 ～ 2011,8) | TOYAMA Hideya |
| Ежемесячный отчет о заседаниях (сентябрь 2010 г. — июль 2011) | ||
| 16-е Ежегодное Общее собрание Общества Исторические исследования китайских женщин | ||
| Устав Общества исторических исследований Китаянки | ||
| Уведомления и послесловие редактора | ||
| No.20 февраля 2011 | ||
| [Статьи] | «Внутренние дела» и «Внешние дела»: женские Экономическая деятельность в провинции Фуцзянь в период песни. | XU Man / Перевод ISHIDA Такако |
| [Перевод] | Размышления о последних трех десятилетиях — Развитие женской истории и гендерной истории как академической дисциплины в Материковый Китай | DU Fangqin / Перевод GOMI Tomoko |
| [Рецензия на книгу] | ИТО Рури, САКАМОТО Хироко, Тани.Э. Барлоу ред., Колониальная современность и современность: империя, капитал и гендер в Восточной Азии (Иванами Сётэн, 2010) | UEMURA Yoko |
| [Обзоры книг] | NOMURA Ayuko, NARITA Sizuka eds., Подходы к Исследование женщин на Тайване (Jinbun Shoin, 2010) | SUDO Mizuyo |
| [Новые книги] | HSU Hui-chi, Новые перспективы и древность Столица: городское потребление в Пекине от переноса столицы в Ранний период антияпонской войны (1928-1937) (Student Book Co., ООО, 2008 г.) | KOHAMA Masako |
| [Деятельность и международный Обмен] | На выставке сексуального насилия, проходившей в Мемориальный музей Армии 8-го маршрута | ISHIDA Yoneko |
| [Деятельность и международный Обмен] | Отчет о конференции по Дин Лин и др. Биржи Сямэнь | AKIYAMA Yoko |
| [Деятельность и международный Обмен] | Энергия, возможности и встречи — рекорд субботнего года в Шанхае, | ISHIKAWA Teruko |
| [Деятельность и международный Обмен] | Отчет по истории китайских женщин Летний семинар ассоциаций | UEMURA Yoko |
| [In Memorium] | Памяти профессора Нодзавы | SUETSUGU Reiko |
| [In Memorium] | Вспоминая профессора Нозаву | МАЭЯМА Канако |
| Приложение: Знакомство с пребыванием поблизости No.58 | ||
| [Хронология] | Хронология истории современного китайского языка Женщины (6) (2009,8 ～ 2010,7) | TOYAMA Hideya |
| Ежемесячный отчет о заседаниях (сентябрь 2009 г. — июль 2010) | ||
| 15-е Ежегодное Общее собрание Общества Исторические исследования китайских женщин | ||
| Устав Общества исторических исследований Китаянки | ||
| публикаций по истории китайских женщин Члены Общества | ||
| Исправления к тому 19; Уведомления и редакция Послесловие | ||
| No.19 февраля 2010 | ||
| [Специальный взнос] | Повседневная жизнь в ранней республике: Свидетельства из Funü shibao (The Women’s Eastern Times) | Джоан СУДЬЯ / Перевод OHASHI Фуми |
| [Исследования] | Изображение целомудрия Тамуры Тайджиро: Перечитывание Никутай но Акама | AKIYAMA Yoko |
| [Отчеты конференции] | Новые тенденции в глобальных исследованиях гендера: О Первом международном симпозиуме по гендерным исследованиям | YAO Yi |
| [Отчеты конференции] | О Шестой ежегодной конференции Ассоциация гендерной истории | UEMURA Yoko |
| [Обзоры книг] | Ю Цзяньминь, внутри и вне спортзала: Физическое воспитание женщин в Восточном Китае, 1895-1937 гг. (Academia Sinica, Институт современной истории, 2009) | СУДО Mizuyo |
| [Обзоры книг] | Тан Шаолин, Столкновения и ожидания: Рассмотрение социальных ролей женщин во времена династии Юань и этические Ожидания (Nankai University Press, 2009) | OSHIMA Ritsuko |
| [Новые книги] | Суэцугу Рэйко, История китайских женщин в двадцатом столетии (Aoki Shoten, 2009) | КОХАМА Масако |
| [Хронология] | Хронология по истории современности Китайские женщины (5) (2008).9-2009,7) | TOYAMA Hideya |
| Ежемесячный отчет о заседаниях (сентябрь 2008-июль 2009) | ||
| 14-е Ежегодное Общее собрание Общество исторических исследований китайских женщин | ||
| Устав Общества Историков Исследования китайских женщин | ||
| публикаций по истории китайских женщин от лиц, не являющихся членами общества | ||
| Уведомления и редакция Послесловие | ||
| No.18 января 2009 г. | ||
| [Статьи] | Представления о сыновней почтительности и Целомудрие в «Терпеливой мести Цай Жуйхуна», глава 36 в Синши Хэнъянь | SENGOKU Tomoko |
| [Исследование] | Гендерное равенство и возраст вступления в брак в Брачное право КНР: внимание к различиям в минимальном законном браке Возраст для мужчин и женщин | MATSUI Naoyuki |
| [Перевод] | намеков из популяризованных исследований Война | Li Xiaojiang ／ Trsnslatede by AKIYAMA Йоко |
| [Обзор фильма] | По фильму «Связанные ноги» | AKIYAMA Yoko |
| [Отчеты конференции] | Новые гендерные перспективы в сфере труда История — Отчет о 5-м заседании Ассоциации гендерной истории | UEMURA Yoko |
| [Обзоры книг] | Судо Мизуё, Изменение взглядов женщин Права в Китае — исследование прав человека и гендера в позднем и раннем периоде Цин. Республиканские периоды | YAO Yi |
| [Обзоры книг] | Сьюзан Манн, Талантливые женщины Семья Чжан, Калифорнийский университет Press, 2007. | GROVE Linda |
| [Новая публикация] | Знакомство с тайваньскими женщинами История | НАРИТА Сидзука |
| [Годовая деятельность] | Дополнения к хронологии История современных китайских женщин | TOYAMA Hideya |
| Отчеты о ежемесячных собраниях — сентябрь 2007 г. к июлю 2008 г. | ||
| 13-е ежегодное деловое собрание Группа исследований истории китайских женщин, | ||
| Положения китайских женщин Историческая исследовательская группа | ||
| Публикации участников | ||
| Пожертвования Группе поддержки сельских женщин в Китае | ||
| исправлений к тому 17; Новые участники; Послесловие от редакции | ||
| No.17 февраля 2008 | ||
| 30 лет Юбилейный выпуск | МАЭЯМА Канако | |
| [Эссе] | Момент в
Целомудрие первого судьи ― Сосредоточение внимания на судебных процессах, проводимых местным судьей в округе Вэньсинь Yiyu | GOMI Томоко |
| [Очерки] | Уголовные дела и женщины в династии Юань | OSHIMA Рицуко |
| [Очерки] | Тоска по и
Сопротивление современности ― Размышление о значении обнаженной натуры
Моделирование инцидент в «Менгке» Дин Линь | EGAMI Сатико |
| [Очерки] | О личности
компании «Ю.Д. » ―О предисловиях и критических комментариях У Цзюенуна к работам, содержащим вопросов. связаны с японскими женщинами | МАЭЯМА Канако |
| [Эссе] | китаянки как
замечено в работе японской журналистки Такенака Шиге — 1920-е гг. к 1930-м годам | СУДО Mizuyo |
| [Эссе] | Защита для
Городские работающие женщины и гендерное равенство в период
Первый пятилетний план ― Сосредоточение внимания на изменениях, произошедших в результате Кампания по критике Сталина | ТОЯМА Хидея |
| [Очерки] | Пол Политика «профессионализации» домашней службы в современном Китай | ОХАСИ Фуми |
| Хронология Современная история китайских женщин (2006.9 2007,8) | ТОЯМА Хидея | |
| Ежемесячное собрание Отчет (сентябрь 2006 г. — август 2007 г.) | ||
| Двенадцатая ежегодная Общее собрание Общества исторических исследований Китая Женщины | ||
| Устав Общество исторических исследований китайских женщин | ||
| Публикации в История женщин, не являющихся членами общества | ||
| Исправление Vol.16, Уведомления и после редакции | ||
| № 16 января 2007 г. | ||
| [Очерки] | Жена и Наложница в официальных семьях — окружающие их обстоятельства и выбор после Смерть | Ли Вэйчжун / Перевод Тучиды Шо |
| [Эссе] | Американец Протестантская женщина-миссионер Лаура М. Уайт и женщина-вестник | CHEN Xing |
| [В память Проф.Янагида Сэцуко] | Первопроходец Роль профессора Янагида | ОНО Казуко |
| [Памяти Проф. Янагида Сецуко] | Воспоминание | Сьюзен Манн |
| [Памяти Проф. Янагида Сецуко] | Проф. Янагида Сэцуко — модель для более позднего поколения | DENG Сяонань |
| [Памяти Проф. Янагида Сецуко] | Воспоминания о Проф. Янагида | МАЭЯМА Канако |
| [Памяти Проф.Янагида Сэцуко] | Памяти Проф. Танигучи Ясуйо | SUETSUGU Рейк |
| [Краткие отчеты] | История и Текущее положение китайских приютов для жертв домашних Насилие | ТОЯМА Хидея |
| [Краткие отчеты] | Десять лет «Дом трудящихся женщин-мигрантов» | HAN Huimin / Перевод OHASHI Fumie |
| [Краткие отчеты] | Предисловие к Японские взгляды на войну — гендерные: десятилетнее китайско-японское сотрудничество Перевод проекта | AKIYAMA Yoko |
| [Книга Обзор] | Хан Цзяньань, Многослойная структура равенства и различий: исследование освобождения женщин Мысли четвертого мая | МИЯГАВА Мари |
| [Хронология] | Хронология Современная история китайских женщин (2005–2006 годы) | ТОЯМА Хидея |
| Ежемесячное собрание Отчет (сентябрь 2005 г. — июль 2006 г.) | ||
| Одиннадцатый ежегодный Общее собрание Общества исторических исследований Китая Женщины | ||
| Устав Общество исторических исследований китайских женщин | ||
| Публикации в История женщин членами общества | ||
| Уведомления и После редакции | ||
| No.15 января 2006 | ||
| [Очерки] | Женская Ответы на движение за новый стиль родов в модерне Китай | ЯО Yi |
| [Очерки] | Чэнь Сяоминь и Женщины-работницы. Внимание к профсоюзу женщин-текстильщиков на раннем этапе 1950-е годы | УДАКА Эмико |
| [Отчет о Даляньская конференция] | Перекресток Культурные границы — исследования женщин и гендерного равенства Опыт | АКИЯМА Йоко |
| [Отчет о Даляньская конференция] | Гендерные вопросы связанных с «женщинами, которые остались в Китае» | KANO Микиё |
| [Отчет о Даляньская конференция] | Мои взгляды на Изучение истории современных японских женщин | HU Peng / Перевод AKIYAMA Yoko |
| [Конференция Отчеты] | 13-й Беркшир Конференция по истории женщин | ISHIKAWA Teruko |
| [Конференция Отчеты] | 9-й Международный междисциплинарный конгресс по положению женщин (Сеул) | СУДО Mizuyo |
| [Книга Обзор] | Хэ Янься, Гендер и современное китайское право — О законах, защищающих женщин (на японском языке) | MATSUI Наоюки |
| [Книга Обзор] | Мурата Юджиро, изд.Современные китайские женщины в «Фуню Зажи» (на японском) | FUJII Ацуко |
| [Хронология] | Хронология Современная история китайских женщин (2004–2005 гг.) | ТОЯМА Хидея |
| Ежемесячное собрание Отчет (сентябрь 2004 г. — июль 2005 г.) | ||
| Десятый ежегодный Общее собрание Общества исторических исследований Китая Женщины | ||
| Устав Общество исторических исследований китайских женщин | ||
| Публикации в История женщин, не являющихся членами общества | ||
| Исправление Vol.14, Уведомления и после редакции | ||
| № 14 января 2005 г. | ||
| [Очерки] | От похвалы Выдающиеся женщины, которые «жалели женщин»: изменения во взглядах Чжоу Цзорен Женщины | Ван Lan |
| [Очерки] | Внутреннее и внешнее Родственники женщин в Сун Фуцзянь | Сюй Ман / Перевод ФУКУДА Рицуко и Яо Йи |
| [Исследование Примечания] | Память, Записи и история: размышления о работе и практике Исиды Ёнэко | HAYAKAWA Noriyo |
| [Исследования Тренды] | Материковый Китай Исследования о женщинах времен династии Сун, публикуемые с 1980-х годов | ЧЭН Юй |
| [Перевод] | Учимся у «Слушать и писать»: о проекте «Женская устная история в ХХ веке». Китай | Ли Сяоцзян / Перевод AKIYAMA Yoko |
| [Книга Обзор] | Янагида Сэцуко, женщины-простолюдины периода песни (Кюуко Сёин, 2003) | OSHIMA Рицуко |
| [Хронология] | Хронология Современная история китайских женщин, 1949-2004 гг. | TOOYAMA Хидея |
| [Памяти Харигая Мивако] | Вспоминая Харигая Мивако | SUETSUGU Рейко |
| [Памяти Харигая Мивако] | От студента Авиационного университета | НАКАБАЯСИ Такако |
| Ежемесячное собрание Отчет (сентябрь 2003 г. — июль 2004 г.) | ||
| На симпозиуме К основанию Общества гендерной истории | ISHIKAWA Теруко | |
| Девятый ежегодник Общее собрание Общества исторических исследований Китая Женщины | ||
| Устав Общество исторических исследований китайских женщин | ||
| Недавние Публикации членов Общества | ||
| Исправление Том 13, Уведомления и послесловие редакции | ||
| No.13 января 2004 | ||
| [Очерки] | Смена дебатов о помощниках по дому — изменение тем в дебатах за последние 20 лет лет | ОХАСИ Фуми |
| [Очерки] | Пол и Структура права в современном Китае — исследование происхождения Правовые принципы, касающиеся специальной защиты женщин в Законе № | HE Янься |
| [Книга Обзор] | Ямадзаки Акико Choyomongai no niji: Sutei jogakko no hitobito (Радуга за пределами Чаояна. Ворота: люди, связанные с женской школой Чунчжэня) | JIAN Shunxun |
| [Переводы] | «Война Опыт — как рассказывают женщины »(предисловие к« Женскому устному сообщению 20 века »(Китай) Сборник истории — Военный опыт Том | Акияма Yoko |
| [Переводы] | китайский Телевизионный документальный фильм «История китайских женщин ХХ века», четвертый Сессия «Возникновение школ для женщин» | Переведено Семинар Эгами женского университета Феррис |
| [Отчеты] | Симпозиум по «Исторический опыт и современность китайских и японских женщин Обстоятельства | Эгами Сатико |
| [Отчеты] | Конференция Международная федерация исследований женской истории по теме «Женщины, семья, Частная жизнь и сексуальность » | Роща Линда |
| [Некролог] | Смерть Профессор Ямазаки Дзюнъитиро | |
| Ежемесячное собрание Отчет (сентябрь 2002 г. — июль 2003 г.) | ||
| Восьмое ежегодное Общее собрание Общества исторических исследований Китая Женщины | ||
| Устав Общество исторических исследований китайских женщин | ||
| Редакция Послесловие | ||
| No.12 января 2003 | ||
| [Очерки] | Исчезающий Ли Баоюй Одновременное формирование старых и новых женских образов в 1903 «Инцидент в павильоне человеческого рода» | СУДО Мидзуйо |
| Распространение и признание «хорошей жены и мудрой матери» между современным Китаем и Японией― Сосредоточьтесь на ХАТТОРИ, Унокичи: его вклад в образование женщин и его Просмотр на женщин | JIN Чонвон | |
| ［Интервью] | Интервью с РС.Цзянь Шусюнь ― Воспоминания об образовании женщин на Тайване и в Японии | Опрашиваемый: ЦЗЯНЬ Шусюнь; Опрашивающие: ХАНГ Юру и СУДО Мизуйо |
| ［Книга Отзывы］ | Широузу Норико, Китайские женщины в двадцатом веке — исследования патриархальной системы в Современный и современный Китай | EGAMI Сатико |
| Накадзима Мидори, перевод и комментарий: «О чтении биографий добродетелей Лю Сяна» Женщины | OSHIMA Рицуко | |
| ［Специальный Отчет］ | на Международная конференция «Гендерный взгляд на женщин Китая» История » | |
| ［Специальный Отчет］ | Размышления о
Международная конференция «Женщины в истории Китая» | |
| Ежемесячное собрание Отчет | ||
| Седьмой годовой Общее собрание Общества исторических исследований Китая Женщины | ||
| Устав Общество исторических исследований китайских женщин | ||
| Публикации в История женщин членами общества | ||
| Редакция Послесловие | ||
Япония, Ямагата, Цуруока, Сагаэ, Новости, Сообщения о дорожном движении, Инахо, Аюко Като PNG клипарт
Япония, Ямагата, Цуруока, Сагаэ, Новости, Сообщения о дорожном движении, Инахо, Аюко Като PNG | HiClipart Япония, Ямагата, Цуруока, Сагае, Новости, Сообщения о дорожном движении, Инахо, Аюко Като, прозрачный фон PNGКлючевые слова
PNG клипарт информации
- PNG Размеры 960×960 пикселей
- Размер файла PNG 80.21 КБ
- Клипарт MIME-тип Изображение / png
- PNG доминирующий цвет синий
Лицензия
HiClipart — это открытое сообщество, в котором пользователи могут обмениваться изображениями PNG, все клипарты PNG в HiClipart предназначены для некоммерческого использования, указание авторства не требуется. Если вы являетесь автором и обнаружите, что этот PNG используется без вашего разрешения, сообщите нам о нарушении Закона США «Об авторском праве в цифровую эпоху» (DMCA), пожалуйста, свяжитесь с нами.
- Эльза Кристофф Анна Олаф Frozen Free Fall, Frozen Logo s, овальный синий цветочный рисунок PNG clipartsize: 1024x486px Размер файла: 186.79 КБ
- иллюстрация белой вихревой линии, синий горошек, точечная синяя линия PNG clipartsize: 1200x1677px размер файла 2.2MB
- Бабочка Blue Phengaris alcon, голубая бабочка, семь синих бабочек PNG clipartsize: 2909x4000px размер файла: 2.07MB
- Градиент синий прозрачный фон PNG clipartsize: 2575x3461px Размер файла 1.78MB
- хирургическая маска маска для лица медицинская маска, синий, бирюзовый, аква, линия, электрик PNG клипарт: 3000x1567px Размер файла: 183.34 КБ
- Акварельная живопись, живопись прозрачным фоном PNG clipartsize: 1024x992px размер файла: 1.1MB
- хирургическая маска медицинская маска COVID19, коронавирус, синий, белый, бирюзовый, аква, сумка, сумочка PNG clipartsize: 1600x1600px Размер файла 1.17MB
- Синий, лента, синяя иллюстрация прозрачный фон PNG clipartsize: 945x591px размер файла: 125.73KB
- Логотип бренда Синий шрифт, поле заголовка синего кольца, прямоугольная бело-синяя иллюстрация доски PNG clipartsize: 2865x2477px Размер файла: 705.12 КБ
- синяя рамка, синий материал, фоновые панели прозрачным фоном PNG clipartsize: 2362x3543px Размер файла 1.56MB
- Электрический синий Aqua Turquoise Teal, синий градиент PNG clipartsize: 1000x1000px размер файла: 10 КБ
- Blue Smoke Cloud, Красивый синий дым, образование синего дыма PNG clipartsize: 1005x1067px Размер файла: 913.2 КБ
- иллюстрация синей точки, область круга, угол синей точки, файл круга PNG clipartsize: 1000x1000px размер файла: 19.86 КБ
- иллюстрация воды, вода синяя, голубая водная рябь PNG clipartsize: 600x466px Размер файла: 125.38KB
- иллюстрация синего пылающего сердца, пламя легкого сердца, синее пламя в форме сердца PNG clipartsize: 650x625px Размер файла: 332.04 КБ
- Голубой лазурный бирюзовый бирюзовый, голограмма, синяя пирамида графика искусство PNG clipartsize: 684x636px Размер файла: 33.69KB
- сине-белый логотип, Paper Origami Banner, баннер PNG clipartsize: 512x512px размер файла: 15.94 КБ
- Рождественская елка MTK Spruce Christmas Day, Fundo de natal Azul PNG clipartsize: 600x600px Размер файла: 241.98KB
- Технология Pattern, Технологическая синяя коробка, прозрачный фон PNG clipartsize: 650x528px размер файла: 179.81KB
- Гроза Молния, бескрайнее небо пастель PNG clipartsize: 900x506px Размер файла: 458.9 КБ
- иллюстрация молнии, графический дизайн, молния PNG clipartsize: 6032x8000px размер файла: 5.63 МБ
- Берег Голубая волна Море Небо, Морской пляж Земля, морская волна в дневное время PNG clipartsize: 2953x1837px Размер файла: 2.84MB
- Magic: The Gathering Curve Line .la Рисунок, кривая прозрачный фон PNG clipartsize: 850x500px размер файла: 367.92KB
- Sky Blue Daytime Energy, небо PNG размером: 1500x750px размер файла: 572.55KB
- Идея синей акварельной живописи, акварельный фон, иллюстрация бело-бирюзового цвета PNG clipartsize: 626x626px Размер файла: 160.25 КБ
- Синий, Синяя абстрактная графика, синий фон прозрачный фон PNG clipartsize: 3553x5075px Размер файла: 726.6KB
- синяя иллюстрация, голубое небо, кривая фон прозрачный фон PNG clipartsize: 2620x1633px Размер файла: 98.01KB
- Кобальтовый синий блеск бирюзовый цвет, голограмма PNG clipartsize: 600x600px Размер файла: 890.33KB
- Цветной дым, Холи, Фестиваль цветов, Цветной пробег, Гулал, Музыка, Синий, Синий кобальт PNG clipartsize: 600x962px Размер файла: 406.85 КБ
- Синяя галочка, флажок, кнопка, компьютер, символ, электронная почта, бирюза, бирюза PNG clipartsize: 1096x1017px Размер файла: 65.57KB
- квадратная неоновая синяя цифровая художественная рамка, синий бирюзовый узор, элементы с эффектом Blu-ray, прозрачный фон PNG clipartsize: 2001x2005px Размер файла: 337.38 КБ
- с новым годом 2020 новый год 2020 2020, синий, аква, бирюза, лазурь, символ PNG clipartsize: 4101x1484px Размер файла: 451.75 КБ
- Больница хирургической маски Scrubs Cap, доктор. шляпа PNG изображения: 1000x1000px размер файла 449.11KB
- Полная луна и звездная ночь, Атмосфера Небо Вселенная Космическое пространство Синий, Фон голубого неба PNG clipartsize: 1920x900px размер файла: 2.03MB
- Веб-разработка .NET Framework ASP.NET MVC Программный фреймворк, microsoft прозрачный фон PNG clipartsize: 512x512px размер файла: 21.16KB
- Блеск Синий Цвет Косметика Ногтей, Блеск Синий PNG clipartsize: 600x600px Размер файла: 625.22 КБ
- синяя папка иллюстрация, синий бирюзовый угол аква, папка прозрачный фон PNG clipartsize: 512x512px размер файла: 6.49KB
- Облако, Акварельная живопись, Художественный музей, Художник, Аква, Бирюза, Синий, Бирюзовый PNG clipartsize: 1622x1171px Размер файла 1.91MB
- Голубая Акварельная живопись Лазурь, Акварельная живопись кисть PNG clipartsize: 1057x758px Размер файла 1.15MB
- Абстракция синего многоугольника, абстрактный фон небесно-голубых многоугольников, иллюстрация сине-голубой и синей рамкой PNG clipartsize: 800x800px Размер файла: 226.02 КБ
- иллюстрация Евклидова иллюстрация, материал с синей заливкой, иллюстрация потока прозрачный фон PNG clipartsize: 812x585px размер файла 62.51KB
- Садовые розы Синяя роза Наклейка PicsArt Studio, космическая эстетика PNG clipartsize: 2896x2896px Размер файла 5.59MB
- синий чехол Apple, электрик бирюзовый дельфин аква, папка абстрактный синий дым PNG clipartsize: 512x512px Размер файла: 297,4 КБ
- Синий евклидов, большие волны, синие линии, фон, синее произведение искусства, прозрачный фон PNG clipartsize: 1513x1107px размер файла: 1.24 МБ
- Синий, Голубой всплеск воды, синяя иллюстрация прозрачного фона PNG clipartsize: 2421x4724px размер файла: 4.65MB
- Бирюзовый бирюзовый круг сфера, були PNG clipartsize: 500x500px размер файла: 161.64KB
- Акварельная живопись Акварель Blue Pinceau à aquarelle, краска PNG clipartsize: 1136x564px размер файла: 506.44KB
- Евклидова ветровая волна Волна, фон плоских синих волн, иллюстрация волны PNG клипарт: 2642x1987px Размер файла: 971.95 КБ
- бирюзовая бумага с фиолетовой иллюстрацией скрепки, стикер для заметок, стикер, липкая заметка PNG clipartsize: 1657x2448px размер файла: 160.71KB
- синий дым, фестиваль цветов Холи Blue The Color Run, холи PNG clipartsize: 508x743px размер файла 100.14KB
- хирургическая маска медицинская маска COVID19, коронавирус, белый, аква, синий, бирюзовый, сумка, бирюзовый PNG клипарт: 1600x1600px размер файла: 1.22 МБ
- Бумага Веб-баннер Страница, Баннер, зеленая, оранжевая и синяя полоса, цифровое искусство PNG clipartsize: 568x524px размер файла: 22.72KB
- Алфавит, Буква, W, Буквенный регистр, I, G, N, Зеленый PNG размер изображения: 512x512px Размер файла: 277.24 КБ
- Синий круг Дневной шрифт, Голубая луна, полная луна PNG clipartsize: 5189x5130px размер файла: 2.07MB
- Веб-страница World Wide Web, Фон визитной карточки, синий фон с наложением текста прозрачный фон PNG clipartsize: 1920x1200px размер файла: 1.78 МБ
- Голубое небо облако бирюзовый шрифт, акварель синие облака, сине-белая абстрактная живопись PNG clipartsize: 1853x875px Размер файла: 188.38 КБ
- иллюстрация голубой ленты, розетка, лента синяя розетка PNG clipartsize: 1316x1473px Размер файла: 315.1 КБ
- удар молнии, розыгрыш электрического экрана Lightning Desktop, световые эффекты PNG clipartsize: 1824x1639px размер файла: 980.52KB
- Гоку Маджин Буу Вегета Наппа Клетка, синяя аура PNG clipartsize: 794x1006px Размер файла: 481.15 КБ
- с новым годом 2020 новый год 2020 2020, текст, число, электрический синий, символ PNG clipartsize: 3781x1485px размер файла: 251.29KB
- синий речевой пузырь, евклидово, текстовое поле прозрачный фон PNG clipartsize: 581x584px размер файла 22.59KB
- Логотип базы данных, сервер базы данных, база данных плоского файла, представление, компьютерные серверы, компьютерное программное обеспечение, плоский файл, восстановление данных PNG clipartsize: 512x512px Размер файла: 65.59KB
- океанская волна, голубая волна, узор неба, элемент волны PNG clipartsize: 2264x1482px Размер файла: 143.9 КБ
- Мусульманская мода баджу курунг хиджаб тхуб, платье PNG клипарт: 503x800px размер файла: 362.64KB
- хирургическая маска медицинская маска COVID19, коронавирус, синий, бирюзовый, аква, носовой платок, постельное белье, текстиль PNG clipartsize: 1600x1600px Размер файла 1.59MB
- медицинская маска хирургическая маска, кружка, бирюза, синий, аква, посуда, символ, посуда PNG clipartsize: 3000x1912px размер файла: 402.15KB
- иллюстрация чирка, синий цветок, ярко-синий узор материала PNG clipartsize: 1962x799px Размер файла: 450.64 КБ
- Логотип Picsart, Наклейка, Глитч-арт, Редактирование изображений, Наклейка, Рисунок, Бирюза, Электрический синий PNG clipartsize: 2289x2289px размер файла: 782.01KB
- Стиральные машины Торговый центр Nguyenkim Стиральное средство Toshiba Электричество PNG clipartsize: 640x746px размер файла: 649.39KB
- Street Fighter II: Мировой воин Рю Акума Marvel vs. Capcom 2: New Age of Heroes, другие PNG clipartsize: 609x468px Размер файла: 288.26 КБ
- иллюстрация галстука в сине-белую полоску, галстук-зажим для галстука, галстук-бабочка, синий галстук PNG clipartsize: 1637x8000px Размер файла 1.58MB
- оранжевый логотип Nike, иллюстрация бренда Nike Free, креативный фон Nike PNG клипарт: 564x729px размер файла: 374.93KB
- белый и синий фон, синяя геометрическая форма, прямоугольник, геометрия, прозрачный фон PNG clipartsize: 1057x1057px Размер файла: 77,2 КБ
- Пламя Света, Красивое синее пламя, синий огонь PNG clipartsize: 2848x4272px размер файла: 13.8 МБ
- Наклейка Хвост Русалки, Русалка PNG clipartsize: 540x1234px Размер файла: 837.09KB
Мы используем файлы cookie для анализа нашего трафика и улучшения предоставляемых нами услуг. Продолжая использовать этот веб-сайт, вы соглашаетесь на использование файлов cookie, как это определено в нашей политике конфиденциальности. принимать
Раков | Бесплатный полнотекстовый | Образованные из опухоли внеклеточные везикулы подавляют функцию естественных киллерных клеток при раке поджелудочной железы
1.Введение
Аденокарцинома протока поджелудочной железы (PDAC) — одно из самых смертоносных злокачественных новообразований во всем мире [1]. У большинства пациентов рак поджелудочной железы диагностируется на поздней стадии без возможности хирургического вмешательства [2]. Даже после резекции R0 с последующей адъювантной химиотерапией и / или лучевой терапией у большинства пациентов в конечном итоге будет рецидив [3]. Программа эпиднадзора, эпидемиологии и конечных результатов (SEER) (https://seer.cancer.gov/statfacts/) показала, что пятилетняя общая выживаемость для пациентов с PDAC с локализованным заболеванием составляет 34.3%. Для тех, у кого есть отдаленные метастазы, этот показатель снижается до 2,7%. Эти устрашающие статистические данные подчеркивают важность улучшения нашего понимания метастатического процесса, чтобы снизить частоту метастазирования и разработать эффективные терапевтические стратегии для пациентов с PDAC. Метастазирование как важный признак рака — это сложный процесс, при котором опухолевые клетки распространяются из места происхождения в отдаленные ткани, также известный как метастатический каскад [4,5]. Термин «дометастатическая ниша» описывает микросреду во вторичном органе, который был затронут первичной опухолью, чтобы поддерживать рост опухоли до входа в опухолевые клетки [6].Многие исследования выявили наличие дометастатических ниш в различных органах, таких как печень и легкие [7,8]. Лю Ю. и др. обобщены шесть характеристик для дометастатической ниши, включая иммуносупрессию, воспаление, лимфангиогенез, ангиогенез / сосудистую проницаемость, органотропизм и репрограммирование [9]. Дометастатическая ниша печени была частично проанализирована на ортотопических моделях мышей PDAC [7]. Однако лежащие в основе механизмы формирования дометастатической ниши в печени остаются неясными для PDAC человека.Внеклеточные везикулы (EV), такие как экзосомы и микровезикулы, могут опосредовать межклеточные коммуникации и, таким образом, влиять на физиологические и патологические состояния посредством переноса различных молекул груза, включая белки, нуклеиновые кислоты и липиды [10,11]. Как липидные двухслойные мембранные везикулы, EV являются одним идеальным носителем для доставки лекарств при лечении рака [12,13]. Kamerkar S et al. успешно модифицировали экзосомы для доставки короткой интерферирующей РНК, специфичной для мутации KRAS, которая подавляла рост опухоли у мышей, несущих PDAC, и значительно увеличивала их общую выживаемость [14].Jang SC et al. синтезировали нанопузырьки путем разрушения моноцитов или макрофагов, которые имели сходные характеристики с экзосомами. Эти нанопузырьки могут доставлять химиотерапевтические препараты для подавления роста опухоли [15]. Саари Х. и его команда загрузили паклитаксел в ЭВ, полученные из раковых клеток. ЭВ, нагруженные паклитакселом, могут доставлять лекарство в клетки рака простаты и повышать его цитотоксичность [16]. Кроме того, исследование, проведенное Garofalo et al. сообщили, что препараты внеклеточных везикул (EV), происходящие из клеток рака легких человека, могут специфически воздействовать на неоплазию.Введение ЭВ с онколитическим вирусом отдельно или в комбинации с химиотерапевтическими средствами может служить новой стратегией лечения рака [17]. Кроме того, ЭВ, полученные из опухоли, могут попадать в кровоток и переноситься в отдаленные участки. Недавние исследования пролили свет на роль опухолевых ЭВ в формировании дометастатических ниш. В мышиных моделях рака легкого и меланомы экзосомы, происходящие из опухоли, доставляли сигналы эпителиальным клеткам легких и активировали Toll-подобный рецептор 3, который вызывал продукцию хемокинов и способствовал инфильтрации нейтрофилов [8].Экзосомы, полученные из PDAC, привлекают макрофаги и нейтрофилы в печень и стимулируют звездчатые клетки печени синтезировать фибронектин, способствующий метастазированию в печень [7]. Кроме того, считается, что экзосомальные интегрины определяют органотропные метастазы [18]. В заключение, происходящие из опухоли экзосомы участвуют в формировании дометастатических ниш, таких как ангиогенез, иммуносупрессия и органотропизм. Природные киллеры (NK) представляют собой группу врожденных лимфоцитов с присущей им способностью распознавать и уничтожать инфицированные вирусом клетки и злокачественные новообразования. клетки.Роль NK-клеток в PDAC привлекает меньше внимания, но получает все большее признание. Gürlevik E et al. сообщили, что после резекции первичной опухоли лечение гемцитабином вызывает цитотоксичность NK-клеток в отношении клеток рака поджелудочной железы и снижает частоту местных рецидивов на моделях ортотопических мышей PDAC [19]. Ames E et al. обнаружили, что NK-клетки преимущественно убивают стволовые клетки рака поджелудочной железы (CSC) in vitro. Внутриопухолевая инъекция NK-клеток мышам NSG, несущим рак поджелудочной железы человека, снизила процент панкреатических РСК и опухолевую нагрузку [20].Однако было установлено, что способность избежать иммунного надзора является отличительной чертой опухолевых клеток [5]. Все чаще исследования показывают истощение NK-клеток в опухоли. Истощенные NK-клетки производят пониженные цитокины, подавляют активирующие рецепторы, а также проявляют нарушенную цитолитическую активность [21,22,23]. Кроме того, в дисфункциональных NK-клетках наблюдается нарушение регуляции клеточного метаболизма. Cong J et al. обнаружили, что на мышиных моделях рака легких экспрессия фермента глюконеогенеза фруктозобисфосфатазы 1 (FBP1) повышается в проникающих в опухоль NK-клетках, что опосредует дисфункцию NK-клеток за счет нарушения гликолиза [24].Механизмы дисфункции NK-клеток включают прямое ингибирование посредством межклеточного контакта и непрямое ингибирование посредством продукции ингибирующих факторов, таких как трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF-β1), интерлейкин 10 (IL-10), простагландин E2 (PGE2), и индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO) [25,26]. Однако на сегодняшний день динамический статус NK-клеток в дометастатической нише PDAC в печени остается неясным. ЭВ, происходящие из опухоли, становятся регулятором модуляции NK-клеток при раке поджелудочной железы.В этом исследовании мы исследовали влияние ЭВ опухолевого происхождения на NK-клетки при раке поджелудочной железы.Здесь мы приводим доказательства того, что ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, несут в себе обильные иммуносупрессивные факторы и подавляют функцию NK-клеток, что способствует образованию дометастатических ниш.
3. Обсуждение
Аденокарцинома протока поджелудочной железы — одно из самых смертоносных злокачественных новообразований [1]. Метастазы являются причиной большинства смертей, связанных с раком, при PDAC. Недавно была предложена преметастатическая ниша для выяснения механизмов органо-специфического метастатического процесса при многих злокачественных образованиях, таких как меланома, рак легких и рак поджелудочной железы [7,8,33].За последние несколько десятилетий электромобили привлекли широкое внимание в области раннего обнаружения, диагностики и лечения рака. Более того, как медиатор межклеточной коммуникации, EVs, высвобождаемые из опухолевых клеток, как обнаружено, взаимодействуют с клетками в удаленных участках органов и, наконец, индуцируют предметастатическую нишу для будущих метастазов [34]. Несмотря на огромные успехи, лежащие в основе клеточные и молекулярные события, участвующие в формировании дометастатической ниши PDAC, еще предстоит определить. В настоящем исследовании ЭВ, происходящие из опухоли, были выделены из двух клеточных линий рака поджелудочной железы человека, L3.6pl и TBO368 путем дифференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования для исключения мертвых клеток, крупного мусора и микровезикул. Затем морфология и распределение электромобилей по размерам были исследованы с помощью ПЭМ и NTA. Экзосомные маркеры, включая CD9, CD63, CD81, TSG101, Alix, глотиллин-1 и Rab5, были идентифицированы с помощью вестерн-блоттинга. Ожидается, что всесторонний протеомный анализ выявит потенциальное влияние опухолевых ЭВ на формирование дометастатической ниши PDAC. Протеомный профиль EV, полученных из линии мышиных клеток PDAC, был проанализирован в предыдущем исследовании.Yu Z et al. сравнивали экзосомы, полученные из клеток Panc02 и Panc02-H7, используя протеомный анализ. Считалось, что дифференциально экспрессируемые белки в экзосомах, происходящих из Panc02-H7, усиливают рост, инвазию и метастазирование опухоли [35]. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором систематически анализируется содержание белка в экзосомах, полученных из PDAC человека. Методом масс-спектрометрии в обоих образцах было обнаружено более 2600 белков. Мы обнаружили, что около 90% белка, идентифицированного в EV, полученных из L3.6pl, перекрывается с белками, идентифицированными в EV, полученных из TBO368.GO-анализ идентифицированных белков был проведен для клеточных компонентов, молекулярных функций и биологических процессов. Группирование по категориям молекулярных функций содержания белка в ЭВ, полученных из рака поджелудочной железы, на основе GO предполагает значительное улучшение локализации и биологической адгезии, которые может способствовать способности EVs прилипать к поверхностям реципиентных клеток, сливаться с их мембранами и переносить экзосомальные компоненты в клетки-мишени, чтобы модулировать их биологические функции.Механизмы органо-специфического самонаведения и колонизации раковых клеток чрезвычайно сложны. Адгезия клеток к внеклеточному матриксу (ЕСМ) определяет колонизацию метастатических участков и способствует выживанию циркулирующих опухолевых клеток в новой среде. Интегрины могут связываться с фибронектином, витронектином, ламинином и коллагеном в ECM, тем самым увеличивая подвижность опухолевых клеток и способность к инвазии [36]. Y Liu et al. сообщили, что после внутривенной инъекции или внутриопухолевой инъекции экзосомы, происходящие от рака легких, были обнаружены в легких и индуцировали дометастатическую нишу легких на моделях мышей [8].Анализ GO показал, что экзосомы, происходящие от рака поджелудочной железы, демонстрируют большое количество молекул клеточной адгезии, особенно интегринов. Аюко Хосино и др. обнаружили, что происходящие из опухоли экзосомальные интегрины определяют органотропные метастазы. Они сообщили, что происходящие из опухоли экзосомы, несущие интегрины α6β4 и α6β1, ответственны за метастазирование в легкие, в то время как экзосомы, несущие интегрин αvβ5, были связаны с метастазами в печень [18]. Наши результаты показали, что интегрин αv и интегрин β5 в большом количестве присутствуют в ЭВ, происходящих от рака поджелудочной железы.После внутривенной инъекции ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, меченные PKH67, достигли печени мышей NSG. Поэтому мы предположили, что происходящие из опухоли ЭВ имеют тенденцию проникать в печень, доставлять грузы к реципиентным клеткам и индуцировать преметастатическую нишу для будущих метастазов в PDAC. Ключевой особенностью преметастатической ниши является иммуносупрессия [9]. . В нашем исследовании анализ ГО показал, что идентифицированные белки в ЭВ, происходящих от рака поджелудочной железы, участвуют в биологической регуляции и процессах иммунной системы.Путем вестерн-блоттинга мы обнаружили, что ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, демонстрируют множество иммунных регуляторных молекул, таких как TGF-β1, нектин-2 и PVR. Таким образом, мы предположили, что ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, могут участвовать в модуляции функций иммунных клеток. Затем мы попытались изучить влияние ЭВ, полученных из рака поджелудочной железы, на NK-клетки. Во-первых, мы обнаружили, что ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, могут быть включены в NK-клетки. Тем не менее, все еще оставалось неясным, могут ли ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, опосредовать подавление иммунитета при совместной инкубации с NK-клетками.Стрессовые белки MICA и MICB широко экспрессируются раковыми клетками из-за повреждения генома [37]. NKG2D является ключевым рецептором, активирующим цитотоксичность NK-клеток [27]. Связывание MICA / MICB с рецепторами NKG2D запускает цитотоксичность, опосредованную NK-клетками, и позволяет им уничтожать раковые клетки [38]. Наши результаты показали, что экспрессия NKG2D на NK-клетках значительно подавлялась ЭВ, происходящими от рака поджелудочной железы. После распознавания и активации NK-клетки синтезируют и высвобождают эффективные цитокины в опухолевые клетки.Например, IFN-γ и TNF-α являются двумя незаменимыми цитокинами для цитотоксичности NK-клеток. Нейтрализация IFN-γ и TNF-α значительно снижает активность NK-клеток [29]. Мы продемонстрировали, что лечение ЭВ приводит к меньшей продукции IFN-γ и TNF-α в NK-клетках. Кроме того, в качестве функционального маркера активности NK-клеток, экспрессия CD107a была значительно подавлена. В последнее время важность клеточного метаболизма иммунных клеток привлекает все большее внимание. Достаточное количество питательных веществ и энергии необходимы для эффекторных функций NK [39].Cong J et al. продемонстрировали, что опухоль может снижать гликолитическую способность NK-клеток, что приводит к снижению цитотоксичности и дисфункции NK-клеток [24]. Мы обнаружили, что NK-клетки демонстрируют меньше CD71 и CD98, а также снижают способность к поглощению глюкозы после обработки EV. Нарушение регуляции метаболизма, вызванное ЭВ, происходящими от рака поджелудочной железы, влияет на множество биологических процессов в NK-клетках, таких как нарушение синтеза белка и нарушение выработки энергии. Наш результат согласуется с предыдущими исследованиями, изучающими влияние ЭВ опухолевого происхождения на иммунные клетки [40,41,42].Наши результаты показывают, что ЭВ, происходящие из рака поджелудочной железы, вызывают дисфункциональный фенотип NK-клеток, которые в конечном итоге вносят вклад в иммуносупрессивное микроокружение в дометастатической нише. Клетки рака поджелудочной железы с экспрессией с высоким содержанием альдегиддегидрогеназы 1 (ALDh2) считаются раковыми стволовыми клетками ( CSC) [43]. Здесь мы обнаружили, что после обогащения с использованием анализа образования сфер, панкреатические CSCs демонстрировали высокую экспрессию лигандов для NKG2D. Однако ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, снижают цитотоксичность NK-клеток в отношении РСК.Считается, что РСК ответственны за метастазирование [44]. Ингибирование цитотоксичности NK-клеток позволило CSC поджелудочной железы ускользнуть от иммунного надзора NK-клеток и колонизировать их в органе-мишени. TGF-β1 как ключевой ингибирующий цитокин играет доминирующую роль в модуляции функции NK-клеток. Например, TGF-β1 ослабляет ответы NK-клеток путем подавления экспрессии NKG2D у пациентов с распространенным раком [45]. Среди различных сигналов, доставляемых ЭВ, происходящими от рака поджелудочной железы, к NK-клеткам, TGF-β1 считался кандидатом, ответственным за дисфункцию NK-клеток.Наши результаты показали, что TGF-β1 нарушает функцию NK-клеток, включая подавление экспрессии NKG2D, CD107a, CD71 и CD98, снижает продукцию цитокинов, таких как TNF-α и IFN-γ, а также снижает способность захвата глюкозы. В общем, активация сигнального пути TGF-β / Smad2 / 3 участвует в дисфункции NK-клеток [32]. Мы обнаружили, что либо ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, либо TGF-β1 могут индуцировать фосфорилирование Smad2 / 3 в NK-клетках. Однако уровень фосфорилирования Smad2 / 3 вернулся к исходному уровню в присутствии SB-431542.Таким образом, мы предположили, что ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, ингибируют функцию NK-клеток посредством пути TGFβ1-Smad2 / 3. EV, происходящие от рака поджелудочной железы, доставляли TGF-β1 на поверхность NK-клеток после связывания с рецепторами TGFβ (TGFβRI / II). Активация TGFβRI / II с помощью TGF-β1 индуцировала фосфорилирование остатков серина / треонина и запускала фосфорилирование Smad2 / 3. Затем фосфорилированный Smad2 / 3 перемещается в ядро и регулирует транскрипцию гена, тем самым модулируя функцию NK-клеток [46].Ингибитор TGFβRI, SB-431542, проявлял цитотоксичность в отношении клеток рака поджелудочной железы in vitro [47]. Необходимы дальнейшие исследования для изучения его противоопухолевого действия in vivo, особенно его влияния на фенотипическое и функциональное разнообразие NK-клеток. Без конкретных симптомов выявление PDAC на ранних стадиях является серьезной проблемой. ЭВ многообещающи для разработки в качестве инструмента жидкой биопсии для раннего выявления и диагностики PDAC [48]. Недавно сообщалось, что уровни экзосомального PD-L1 в плазме, а не растворимого PD-L1, были связаны с прогрессированием заболевания у пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи (HNSCC) [49].В нашем исследовании мы измерили уровни сывороточных EV ‘TGF-β1 у пациентов с PDAC. Интересно, что по сравнению со здоровыми донорами уровень TGF-β1 сывороточных EV был значительно повышен в группе PDAC. Таким образом, TGF-β1 сывороточных EV может быть использован в качестве диагностического инструмента для обнаружения PDAC. Помимо TGF-β1, EV, полученные из рака поджелудочной железы, также содержат множество других иммунорегулирующих факторов, таких как PVR и нектин-2, которые могут быть доставлены в качестве тормозных сигналов к NK-клеткам. И PVR, и нектин-2 могут связываться с ингибирующими рецепторами на NK-клетках, включая CD96, PVRIG и TIGIT [50].Следовательно, помимо TGF-β1, PVR и нектин-2 в ЭВ, происходящих от рака поджелудочной железы, также могут нарушать функцию NK-клеток. Было продемонстрировано, что ось PVR / нектин-2-TIGIT участвует в ослаблении цитотоксичности NK-клеток [51]. В качестве контрольной точки блокада рецепторов TIGIT предотвращает дисфункцию NK-клеток и вызывает противоопухолевые ответы NK-клеток на моделях мышей с опухолями [52]. Ингибиторы иммунных контрольных точек, нацеленные на CTLA-4, PD-1 и PD-L1, показали клиническую пользу для пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), распространенной меланомой и некоторыми другими видами рака [53,54,55].Однако эти ингибиторы менее эффективны у пациентов с PDAC [56]. Наши результаты показывают, что TIGIT представляет собой потенциальную иммунотерапевтическую мишень для PDAC. Тем не менее, ограничение настоящего исследования состоит в том, что in vivo эффекты EV, полученных из рака поджелудочной железы человека, на NK-клетки не исследовались. Для решения этой проблемы гуманизированные мышиные модели ксенотрансплантата, полученные от пациентов, которые могут лучше воспроизводить гетерогенность опухоли и моделировать сложность иммунной системы, служат лучшей платформой для дальнейших исследований [57].В заключение мы предложили новый механизм иммунного ускользания при PDAC. Рак поджелудочной железы может образовывать дометастатическую нишу в печени через опухолевые ЭВ. ЭВ, происходящие от рака поджелудочной железы, несущие иммуносупрессивные грузы, опосредуют дисфункцию NK-клеток. Метастатические раковые клетки поджелудочной железы ускользают от иммунного надзора со стороны NK-клеток и в конечном итоге вызывают метастазы в печени. Кроме того, сывороточный EV TGF-β1 может представлять собой многообещающий неинвазивный диагностический инструмент для PDAC.
4.Материалы и методы
4.1. Культура клеток
Клетки рака поджелудочной железы человека L3.6pl были выделены и созданы после нескольких циклов селекции in vivo на голых мышах [58]. TBO368 был получен с письменного согласия пациента с раком поджелудочной железы и впоследствии установлен в качестве первичных культур клеток с низким пассажем. Исследование было одобрено этическим комитетом Кельнского университета (BIOMASOTA, (Biologische Material Sammlung zur Optimierung Therapeutischer Ansätze), ID: 13-091, одобрение в мае 2016 г.).L3.6pl культивировали в среде DMEM (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) с добавлением 10% FBS (об. / Об.), 1% смеси витаминов, 1% пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот, 1% L. -глютамин и 1% пенициллин / стрептомицин (FBS от Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Германия) (другие от Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, США). TBO368 культивировали в усовершенствованной среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% FBS, 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина. Линия NK-клеток человека Клетки NK92 были получены из ATCC и культивированы в среде MEM α, без нуклеозидов (Gibco), содержащей 12.5% FBS, 12,5% лошадиной сыворотки (Gibco), 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0,02 мМ фолиевой кислоты, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 мМ мио-инозитола, 2 мМ l-глутамина и 100 Ед. / мл рекомбинантного человеческого ИЛ-2 (Peprotech, Гамбург, Германия).4.2. Изоляция EV
Для получения EV из супернатантов клеточных культур клетки рака поджелудочной железы с конфлюэнтностью 70–80%, около 1,5 × 10 7 клеток, промывали 3 раза физиологическим раствором с фосфатным буфером Дульбекко (DPBS) и культивировали в 25 мл среды с добавлением 10% FBS, не содержащего ЭВ, в течение дополнительных 24 ч в колбе Т-175.EV были выделены с использованием метода дифференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования. Вкратце, супернатанты центрифугировали при 300 × g в течение 10 минут и 2000 × g в течение 10 минут при 4 ° C для удаления мертвых клеток и клеточного дебриса. Супернатанты переносили в новые пробирки и центрифугировали при 10000 × g в течение 30 мин при 4 ° C для удаления крупных пузырьков. Затем 120 миллилитров супернатанта переносили в пробирки для ультрацентрифугирования и ультрацентрифугировали при 100000 × g в течение 70 мин при 4 ° C (Beckman Coulter, OptimaTM L-90K, Индианаполис, Индиана, США).После первого раунда ультрацентрифугирования супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в PBS и снова ультрацентрифугировали при 100000 × g в течение 70 мин при 4 ° C. EV ресуспендировали в 100 мкл PBS и хранили в морозильной камере при -80 ° C менее одного года.
EV из сыворотки выделяли методом преципитации с использованием ExoQuick (System Biosciences, Пало-Альто, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, образцы сыворотки центрифугировали при 3000 × g в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) для удаления оставшихся клеток крови и клеточного дебриса.После центрифугирования 250 мкл сыворотки помещали в новую пробирку и смешивали с 63 мкл раствора для преципитации экзосом ExoQuick (System Biosciences, Пало-Альто, Калифорния, США). Смесь инкубировали при 4 ° C в течение 30 минут, а затем центрифугировали при 1500 × g при 4 ° C в течение 30 минут. Супернатант аспирировали. Пробирку центрифугировали при 1500 × g в течение дополнительных 5 мин для удаления остаточного раствора ExoQuick. Осадок полностью ресуспендировали в 100 мкл PBS. ЭВ сыворотки хранили в морозильной камере с температурой -80 ° C менее одного года.
4.3. Анализ отслеживания наночастиц
Распределение размеров ЭВ, полученных из рака поджелудочной железы, исследовали с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA). Вкратце, фоновые измерения были выполнены с фильтрованным PBS, который показал отсутствие каких-либо частиц. EV разбавляли PBS в соотношении 1: 1000. После загрузки образца были записаны пять повторных измерений, а затем проанализированы с помощью Nanosight NS300 с программным обеспечением NTA 3.0 (Malvern Instruments, Malvern, UK).
4.4. Просвечивающая электронная микроскопия
Морфологию ЭВ, полученных из рака поджелудочной железы, оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). Вкратце, ЭВ помещали на сетку электронной микроскопии, покрытую формваром и углеродом, на 10 мин во влажной камере. После непродолжительного промокания края сетки фильтровальной бумагой сетки помещали на капли 2% водного уранилацетата на 1 мин, удаляли, снова промокали и помещали на капли H 2 O на 1 мин, удаляли и промокали край. После 24 часов сушки на воздухе решетки исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (Zeiss EM 912 Omega при 100 кВ, Дармштадт, Германия).
4.5. Вестерн-блот
Клетки и EV лизировали с использованием буфера М для полного лизиса с добавлением коктейля ингибиторов фосфатазы (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Образцы белка центрифугировали при 14000 × g в течение 15 мин при 4 ° C. После центрифугирования супернатанты переносили в новые пробирки и хранили в морозильнике при -80 ° C. Концентрации белка измеряли с помощью анализа белка BCA (Thermo Scientific ™, Уолтем, Массачусетс, США). Образцы белка готовили в буфере для образцов Pierce ™ LDS (Thermo Fisher Scientific), кипятили в течение 10 минут при 70 ° C.Загружали от десяти до пятнадцати микрограммов лизатов и прогоняли в полиакриламидных гелях с SDS. Затем гели переносили на мембраны из ПВДФ. Мембраны блокировали блокирующим буфером при комнатной температуре в течение 1 ч и инкубировали со специфическими первичными антителами при 4 ° C в течение ночи (таблица S2). Блоты промывали 3 × 5 мин в PBST. Инкубацию с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. Блоты снова промывали TBST 3 × 5 мин. Белки детектировали с помощью хемилюминесценции с хемилюминесцентным субстратом SuperSignal ™ West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific) с использованием Intas ChemoStar ECL Imager (Intas Science Imaging, Геттинген, Германия).4.6. Проточная цитометрия EV
EV, происходящие из рака поджелудочной железы, инкубировали с полибусальными карбоксилатными микросферами (Polyscience, Niles, Illinois, USA) в PBS в течение ночи при 4 ° C. Образцы блокировали 2% BSA в PBS и центрифугировали при 350 × g в течение 2 минут. Супернатанты отбрасывали. Осадки дважды промывали PBS и ресуспендировали в PBS. EV инкубировали с антителом к CD63 при 4 ° C в течение 20 минут в темноте. Образцы анализировали с помощью CytoFlex (Beckman Coulter, Индианаполис, Индиана, США).
4.7. Проточная цитометрия клеток
Для окрашивания поверхности клетки инкубировали с Human TruStain FcX ™ (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США) на льду в течение 10 мин. Затем добавляли конъюгированные флуоресцентные антитела и инкубировали на льду в течение 20 минут в темноте. После инкубации клетки дважды промывали PBS и затем анализировали проточной цитометрией. Для внутриклеточного окрашивания проводили окрашивание поверхностным антигеном, как указано выше. После этого клетки промывали и фиксировали в буфере для фиксации (Biolegend) в течение 20 мин при комнатной температуре.Клетки промывали и повышали проницаемость промывочным буфером для повышения проницаемости (Biolegend). Клетки инкубировали с соответствующими конъюгированными флуоресцентными антителами в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре. После инкубации клетки дважды промывали промывочным буфером для повышения проницаемости и анализировали проточной цитометрией. Для каждого образца было получено 30 000–50 000 событий с использованием CytoFlex (Beckman Coulter). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Treestar Inc., Ashland, США).
4.8. Масс-спектрометрия EV
Пятьдесят микрограммов EV, полученных из рака поджелудочной железы, использовали для масс-спектрометрических анализов.Сначала ЭВ денатурировали с использованием 8 моль / л мочевины с коктейлем ингибиторов протеазы. Образцы центрифугировали в течение 15 минут при 17000 × g для удаления мусора. Концентрацию белка определяли с помощью спектрометра Direct Detect ® (Дармштадт, Германия). Затем по 50 мкг на образец переносили в новую пробирку объемом 1,5 мл. Образцы восстанавливали с использованием 5 мМ DTT при 25 ° C в течение 1 часа и инкубировали с 40 мМ хлорацетамида в темноте в течение 30 минут. После этого проводили протеолитическое расщепление лизилэндопептидазой (Lys-C) при соотношении фермент: субстрат 1:75 при 4 ° C в течение 4 часов.Образцы разбавляли 50 мМ триэтиламмонийбикарбонатом (TEAB) для достижения конечной концентрации мочевины ≤2 М. Выполняли последующее расщепление трипсином при соотношении фермент: субстрат 1:75 и инкубацию при 25 ° C в течение ночи. Переваривание останавливали муравьиной кислотой до конечной концентрации 1%. После расщепления смеси пептидов обессоливали, используя самодельный StageTip на образец (содержащий 2 слоя дисков SDB-RPS). Наконечники StageTips были уравновешены следующим образом: 20 мкл метанола, центрифугирование при 2600 об / мин в течение 1 мин; 20 мкл 0.1% муравьиная кислота в 80% ацетонитриле, центрифугирование при 2600 об / мин в течение 1 мин; 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, центрифугирование при 2600 об / мин в течение 1,5 мин; 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, центрифугирование при 2600 об / мин в течение 2 мин. Образцы (подкисленные муравьиной кислотой) центрифугировали на полной скорости в течение 5 минут, а затем загружали на уравновешенные наконечники StageTips. После центрифугирования при 2600 об / мин в течение 5 минут наконечники StageTips были промыты в соответствии со следующим протоколом: 30 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, центрифугирование при 2600 об / мин в течение 3 минут; 30 мкл 0.1% муравьиная кислота в 80% ацетонитриле, центрифугирование при 2600 об / мин в течение 3 мин. Последний этап промывки был выполнен дважды. Наконец, наконечники StageTips были полностью высушены шприцем и выдержаны при 4 ° C до анализа ЖХ-МС. Нано-ЖХ-МС выполняли с использованием градиента в течение 150 мин и анализировали с использованием MAXQuant (Институт биохимии Макса Планка, Мартинсрид, Германия) и программного обеспечения Perseus (Институт биохимии Макса Планка, Мартинсрид, Германия).
4.9. Анализ поглощения EV in vitro
EV, происходящие из клеток рака поджелудочной железы, выделяли, как описано выше.Набор флуоресцентных линкеров клеток PKH67 (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) использовали для маркировки электромобилей в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, после первого раунда ультрацентрифугирования супернатант удаляли, а осадок EV ресуспендировали в 750 мкл разбавителя C. Один микролитр красителя PKH67 растворяли в 250 мкл разбавителя C. EV и краситель PKH67 осторожно смешивали. и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Для связывания избытка красителя PKH67 добавляли девять миллилитров PBS с 1% BSA. EV ультрацентрифугировали при 100000 × g в течение 70 мин при 4 ° C и дважды промывали PBS ультрацентрифугированием.Затем EV, меченные PKH67, ресуспендировали в PBS. NK-клетки инкубировали с EV, меченными PKH67, в течение 24 часов и помещали на слайды для адгезии полизина на 30 минут при 37 ° C. После фиксации и пермеабилизации NK-клетки окрашивали DAPI. Поглощение меченных PKH67 EV NK-клетками визуализировали с помощью конфокальной микроскопии.
4.10. Распределение EV in vivo
Для изучения распределения in vivo EV, полученных из рака поджелудочной железы, EV были флуоресцентно помечены, как описано выше. Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными ответственными национальными и местными властями (81-02.04.2018.A139, LANUV NRW, утвержден 20 сентября 2018 г.). Меченые PKH67 EV вводили в хвостовую вену двух здоровых мышей NSG в возрасте 4–6 недель. Одной мыши NSG вводили PBS в качестве отрицательного контроля. Через двадцать четыре часа после инъекции мышей умерщвляли. Органы вскрывали и помещали в Tissue-Tek O.C.T.TM. Затем образцы замораживали и хранили при -80 ° C. Для иммунофлуоресценции 10 мкм криосрезов ткани O.C.T.TM окрашивали DAPI. Распределение меченых PKH67 EV анализировали с помощью конфокальной микроскопии.
4.11. Анализ цитотоксичности NK-клеток in vitro
клеток L3.6pl (2 × 10 5 ) высевали с NK-клетками (эффектор: мишень = 5: 1) в 6-луночный планшет. Все лунки содержали 100 МЕ / мл rhIL-2 с 50% среды для NK-клеток и 50% культуральной среды L3.6pl. После совместного культивирования в течение 24 ч планшеты трижды промывали DPBS. Прилипшие клетки собирали и подсчитывали для последующих экспериментов.
4.12. Анализ образования сфер
клеток L3.6pl высевали в виде одноклеточной суспензии в концентрации 2000 клеток / лунку в 6-луночные планшеты со сверхнизким прикреплением (Corning Inc., Corning, NY, USA) в среде DMEM / F12 (Gibco) с добавлением 20 нг / мл EGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ), 20 нг / мл bFGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ), 5 мкг / мл инсулина. (Sigma-Aldrich, Миссури, США) и 1 × B27 (Gibco). Через 7 дней шарики подсчитывали под микроскопом. Сферы собирали для экстракции мРНК и анализа проточной цитометрии.
4.13. Выделение РНК, синтез кДНК и qRT-PCR
Общую РНК выделяли из культивируемых клеток в соответствии с инструкциями производителя с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия).РНК подвергали обратной транскрипции согласно протоколу производителя с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Затем синтезированную кДНК оценивали на экспрессию генов с использованием мастер-микса Fast SYBR green (Invitrogen) с QuantStudio 7 flex (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, США).
4.14. Исследования на людях
Все образцы тканей и крови человека были собраны с соблюдением этических норм, и их использование в исследованиях соответствовало условиям информированного согласия (BIOMASOTA, ID: 13-091, одобрение в мае 2016 г.).Образцы периферической крови человека были взяты у здоровых субъектов и пациентов с PDAC в Университетской клинике Кельна в период с октября 2016 года по декабрь 2018 года. Все пациенты с PDAC были патологически подтверждены. Кровь получали и центрифугировали при 2000 об / мин 10 мин и 4000 об / мин 10 мин при комнатной температуре.