Средство для стирки мембранной одежды – нужно или нет?
Автор admin На чтение 5 мин Просмотров 1.8к. Опубликовано
Мембранная тканьСредство для стирки мембранной одежды – есть ли в нем необходимость, или же можно проводить чистку обычными порошками? Для начала разберем, что такое ткань из мембраны, для чего она предназначена, и как происходит ее чистка. Также мы детально расскажем и покажем в видеоматериалах весь процесс стирки.
Содержание
- Свойства ткани
- Правила стирки
- Средства
- Ручная чистка
Свойства ткани
Прежде чем подбирать порошки, нужно выяснить, какими свойствами обладает ткань. Некоторые изделия трудно отстирать в машинке, но хорошо чистятся в тазу. Перепоночные ткани защищают одежду от намокания, однако выводят пары наружу.
- Для производства непромокаемой обуви;
- В верхних слоях одежды;
- На аксессуарах;
- В изготовлении сумок;
- Для защиты агрегатов от попадания влаги.
Диафрагменная ткань также считается непродуваемой, отличается пропитками и свойствами. Некоторые из них используются для занятия активными видами зимнего спорта, для рыбалки, другие предназначены для спокойного отдыха с детьми. Существуют следующие типы мембранной поверхности:
Мембранная ткань с флисовой подкладкой Полартек с мембраной Термобелье с мембранным слоем Двухслойная мембрана Трехслойная поверхность Ламинирующая ткань с трикотажем Беспоровая ткань Мембрана с порами Комбинированные поры 2,5 слойные мембраныВ зависимости от типа вашей ткани следует выяснить, как стирать мембранную одежду в стиральной машине.
Правила стирки
В стиральной машине можно проводить чистку мембранной одежды, но не обуви.
Для этого всегда важно правильно выбрать режим. Это будет зависеть от комбинации поверхностей.
Многослойные ткани | Они требуют очистки через деликатный режим. При этом категорически нельзя дополнять процесс отжимом. Температура должна быть 20 градусов и не более. |
Комбинированные ткани | Мембрана, содержащая несколько слоев и имеющая между ними пористые прокладки, не должна стираться в стиральной машине, если там нет режима «ручная стирка». |
Ткань с прослойками | Лучше всего отдать предпочтение щадящему режиму, температуру выбрать до 30 градусов. Сушка должна проводиться в горизонтальном положении. |
Ткань с подкладкой | Исходя из того, какая подкладка есть на мембране, можно выбрать тот или иной режим, соответствующий деликатной настройке машины. |
Совет: Не применяйте агрессивных средств при мойке. Некоторые хозяйки спрашивают, а можно ли стирать мембранную одежду обычным порошком.
Нет, любой порошок забивается в поры перепонки, от чего она перестает «дышать», теряя свои свойства.
Нет, любой порошок забивается в поры перепонки, от чего она перестает «дышать», теряя свои свойства.Средства
Поскольку сыпучие средства не предназначены для такого типа белья, чем стирать мембранную одежду, расскажем далее.
DOMAL Sport Fein FashionБальзам для стирки спортивной одежды подходит для полиэстера, ткани с перепонками и синтетических волокон. Хорошо отстирывает пятна в машинке автомат.
Nikwax Tech WashМоющее предназначено для глубокой очистки поверхности мембранной одежды с функцией пропитки. Поскольку простыми средствами пропитывать ткань не рекомендуется, подойдет такой жидкий порошок. Также он сохраняет водоотталкивающие свойства ткани и не нарушает верхний слой «дышащей» оболочки.
Denkmit Fresh SensationГель для стирки мембранной одежды, который хорошо справляется с трудными пятнами, однако не имеет пропитки. Она необходима для сохранения долговечности ткани. Но можно отдельно приобрести такую аэрозоль от фирменного производителя.
Единственное средство, которое можно применять для тканей с диафрагменными прослойками. Также подходит для чистки обуви и другой различной спортивной одежды и аксессуаров. Можно применять для ручной стирки.
Хозяйственное мылоНичего удивительного, ведь состав его имеет натуральные компоненты с химической базой. Возможна только ручная стирка.
Подобные средства для стирки мембранной одежды лучше покупать в специализированных магазинах, где снижен риск приобретения подделок. Если вы не смогли найти какие-либо моющие, нет у вас пропитки или аэрозоли, не поддавайтесь соблазну пойти в химчистку.
Ручная чистка
Кроме стиральной машинки быстро очистить одежду помогут наши советы для проведения ручного застирывания. Ниже инструкция покажет, как правильно стирать мембранную одежду, и что стоит запомнить в процессе сушки.
Таз | Подготовьте воду температурой 20-30 градусов. Положите на 20 минут одежду в воду, дождитесь, когда она полностью пропитается. Не всегда верхний слой впитывает жидкость даже при длительном замачивании, поэтому чередуйте – переворачивайте разными сторонами одежду к поверхности воды. |
Моющее | Выберите гель из вышеперечисленных средств или воспользуйтесь хозяйственным мылом. Натрите поверхность ткани средством. Не добавляйте его в воду, оно не впитается в поры ткани. При этом прямое нанесение возможно только руками без использования губок и щеток. |
Стирка | Чистить в тазу ткани из перепонок можно только при помощи проточной воды. После нанесения моющего, промыть под струей. Холодная вода должна вымыть все остатки чистящих компонентов. |
Промывка | Промыть и смыть все компоненты средства нужно без использования скручивания или отжима. Вообще никаких манипуляций с тканью делать нельзя. |
Сушка | Сушить мембранную одежду можно и в вертикальном положении. Вода будет стекать вниз. Переворачивайте вещь, чтобы капли, застрявшие в порах, стекали обратно и испарялись быстрее. |
Совет: Стирка одежды из мембранной ткани, а также сушка, должны проводиться согласно предписаниям, которые отмечены на ярлыке изделия.
В противном случае, если вы не нашли специальных средств, которые указаны на фото, не можете подобрать режим в стиральной машине, или же цена гелей и пропиток вам просто недоступны, вы можете прибегнуть к стирке хозяйственным мылом. Выбирайте детские или те виды, которые содержат примеси смягчающих компонентов. Видео в этой статье
также расскажет, чем пользуются хозяйки в подобных случаях, чтобы начисто вымыть одежду, не испортив ее свойств.
Лучшие чистящие средства для мембраны: стирка, уход и восстановление
Изделия с мембраной идеально подходят для спортсменов, туристов и любителей активного отдыха. Подобная одежда не только позволяет выводить излишнюю влагу, но и обладает водоотталкивающими свойствами, благодаря используемой DWR-пропитке.
Для очистки мембранной одежды нельзя использовать сухие бытовые стиральные порошки, имеющие кристаллическую структуру, которая полностью не растворяется в воде и закупоривают поры, вследствие чего изделие перестает пропускать воду и воздух. Такие порошки, а также пятновыводители и отбеливатели, обладают агрессивным химическим составом, пагубно воздействующим на ткань, разрушают синтетические волокна и нарушают водоотталкивающее покрытие.
Изделия прослужат вам дольше, если придерживаться несложных рекомендаций.
Общие рекомендации по уходу за изделиями с мембраной
- При выборе очищающих средств необходимо отдать предпочтение жидким гелям и шампуням
- Не замачивать одежду перед стиркой
- Оптимальная температура для стирки изделий с мембраной — +30…+40 °C
- Стирку мембраны в стиральной машине следует производить в деликатном режиме, предварительно вручную застирав сильные загрязнения и пятна
- Перед стиркой необходимо проверить карманы на наличие посторонних предметов
- Не рекомендуется отжимать во избежание нарушения целостносной структуры мембраны
- После удаления загрязнений изделие рекомендуется обработать средством на основе фтора для восстановления водооталкивающего покрытия
- Не рекомендуется сушить изделия вблизи любых нагревательных элементов и под прямыми солнечными лучами
- Изделия с мембраной нельзя гладить напрямую и на высоких температурах
Грамотно подобранные чистящие средства для мембраны увеличивают срок службы экипировки, эффективно удаляют загрязнения и обеспечивают сохранность ткани, не забивая поры мембран и не препятствуя циркуляции воды и воздуха.
Ниже представлен список популярных средств для стирки мембраны
| № п/п | Наименование | Страна | Описание |
|---|---|---|---|
| 1 |
Жидкое мыло Nikwax Tech Wash |
Великобритания |
Моющее средство без резкого запаха, подходит для ручной и машинной стирки, восстанавливает водоотталкивающую пропитку. |
| 2 |
Жидкое средство Woly Sport Textile Wash Plus |
Германия |
Средство для стирки одежды из мембраны. Экономное расходование, подходит для ручной стирки и в стиральной машине. |
| 3 |
Жидкий бальзам Washbalsam Nordland |
Германия |
Экономичное средство с резким запахом, содержит биоразлагаемые органические компоненты. |
| 4 |
Жидкий шампунь Salton Sport |
Россия |
Недорогое экономичное средство с резким запахом, сильно пенится, требует 3–4 полоскания. |
|
5 |
Жидкое средство 2 в 1 Grangers 2in1 Wash & Repel |
Великобритания |
Очищающее средство, предназначенное для стирки и восстановления водооталкивающего слоя. |
|
6 |
Жидкий гель Ласка Active&Fresh |
Россия |
Универсальное недорогое средство с резким запахом, мягко воздействует на материал, подходит для ручной и машинной стирки. |
|
7 |
Жидкий гель Perwoll Sport & Active |
Австрия |
Эффективно справляется с загрязнениями, не оставляет разводы. |
|
8 |
Германия |
Экономичное стиральное средство для мембраны, оказывающее мягкое воздействие на ткань, подходит для ручной и машинной стирки, содержит водоотталкивающую пропитку. |
|
|
9 |
Жидкое средство Hey Sport Tex Wash |
Германия |
Подходит для ручной и машинной стирки |
|
10 |
Жидкое средство для стирки Burti Sport Outdoor |
Германия |
Экономичное гипоаллергенное средство, содержит органические компоненты. |
|
11 |
Жидкий гель Heitmann Spezial wasche |
Германия |
Экономичное средство без сильного запаха. |
| 12 | Жидкий шампунь Holmenkol Textile Wash | Германия | Эффективно справляется с сильными загрязнениями, недостаток — высокая цена. |
При локальных загрязнениях одежду можно очистить с помощью натертого хозяйственного мыла, растворенного в теплой воде и взбитого в легкую пену. Щадящими движениями необходимо обработать изделие при помощи мягкой губки или зубной щетки с мягкой щетиной.
Также можно использовать профессиональные спреи с дозаторами. Например, Granger s Universal Spray Cleaner.
В процесс эксплуатации и во время стирок водооталкивающее покрытие изнашивается. На помощь приходят средства, восстанавливающие функциональные свойства ткани.
Средства для восстановления водоотталкивающего слоя на верхней одежде
| № п/п | Наименование | Страна |
|---|---|---|
| 1 |
Пропитка для мембранных тканей Nikwax TX. Direct Wash-in
|
Великобритания |
| 2 | Пропитка для мембранных тканей Nikwax TX.Direct Spray-On | Великобритания |
| 3 | Водоотталкивающая пропитка для пуха Nikwax Down Proof | Великобритания |
| 4 | Пропитка Grangers Clothing Repel | Великобритания |
Пусть изделия прослужат вам долго, не теряя свои потребительские качества.
7 советов по улучшению результатов вестерн-блоттинга
Белки — это молекулярный механизм клетки, обеспечивающий выполнение каждой клеткой тела своей конкретной роли. Ученые часто хотят изучать белки, и один из способов добиться этого — вестерн-блоттинг.
Это метод, использующий антитела для идентификации интересующего белка из смеси в биологическом образце. Во-первых, образцы разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза. Затем белки переносят на твердую мембрану, либо из нитроцеллюлозы, либо из ПВДФ, после чего следует этап блокирования для предотвращения неспецифического связывания антител с мембраной. Исследуемый белок исследуется с помощью специфического антитела и, наконец, выявляется вторичным антителом, часто конъюгированным с флуорофором. Затем мембрану можно сканировать, чтобы визуализировать интересующий белок.
В первые несколько месяцев работы над докторской диссертацией я много раз пытался провести вестерн-блоты (о чем раньше я только читал, я имею в виду, насколько сложно было получить хорошую единственную группу на чистом блоте?). Это определенно было не так просто, как я ожидал — я получал разные результаты с каждым пятном, и мои пятна ВСЕГДА были полны пятен на заднем плане.
Это побудило меня заняться поиском и устранением неисправностей на пути к идеальному вестерну, и здесь я дам несколько советов, как этого добиться.
ОЧИСТИТЬ ВСЕ
Это невозможно переоценить. Любая грязь, пыль или остатки геля на пластинах или мембране БУДЕТ отображаться в качестве фона на ваших пятнах. И, поскольку жизнь несправедлива, мне казалось, что фон всегда совпадает с тем, где должны быть мои полосы, поэтому они мешают любой последующей количественной оценке. Одним из способов предотвращения фона является очистка всех пластин и гребенок 1% SDS или 70% этанолом, а затем дистиллированной водой, а затем вытирание насухо. Кроме того, убедитесь, что вы всегда носите перчатки и все другое оборудование, например. щипцы тоже чистые.Хотите прочитать это в формате PDF?
СКАЧАТЬ ЗДЕСЬ
Приготовление вашего лучшего геля
Иногда на подготовку образцов перед проведением вестерн-блоттинга уходят часы работы; но если гель не приготовлен должным образом, вся ваша тяжелая работа может быть потрачена впустую, что было бы огромным позором!Следуйте своим рецептам
Убедитесь, что ваши растворы приготовлены правильно и имеют правильный pH; укладывающий гель обычно является кислым при рН 6,8, а разделительный гель является щелочным при рН 8,8.
Процентное содержание акриламида
Процентное содержание акриламида, которое вы используете, пропорционально тому, насколько легко белки проходят через гель. Если интересующий вас белок имеет низкую молекулярную массу и содержание акриламида слишком низкое, вы рискуете, что он вытечет из геля. Прежде чем приступить к приготовлению геля, проверьте молекулярную массу белков и решите, какое процентное содержание геля является наиболее подходящим.
Дайте гелю достаточно времени для полимеризации
Обычно я готовлю немного больше концентрирующего и разделительного геля, поэтому я могу проверить пробирку, в которой я приготовил растворы, чтобы увидеть, полимеризовались ли они, а не манипулировать самим гелем. Я обнаружил, что приготовление свежего 10% АПС улучшило полимеризацию моих гелей, и подготовка не заняла много времени. Если гель не полимеризовался должным образом, это может привести к появлению «волнистых» полос. На этом этапе лучше запастись терпением!
Не давать гелю высохнуть
После заливки разделительного геля (убедитесь, что вы оставили достаточно места для укладочного геля и расчески) заполните пустое пространство гидратированным изопропанолом, пока он полимеризуется.
Это гарантирует, что вы получите ровную линию в верхней части разделительного геля, и он не высохнет! После того, как разделительный гель полимеризуется, вы можете слить оверлейный раствор, хорошо промыть ddh3O, прежде чем приступить к заливке сверху вашего укладочного геля. После того, как вы приготовили гель, обязательно используйте его вскоре после этого и старайтесь не оставлять его при комнатной температуре. Если вы заранее приготовили гели, есть способы сохранить их для будущего использования. Вы можете обернуть их бумагой, пропитанной SDS Running Buffer, или налить немного ddh3O поверх геля и запечатать его в пакете с застежкой-молнией. Гели можно хранить при температуре 4°C в течение нескольких дней. Если гель начнет сжиматься по краям, лучше всего начать сначала!
Красное к красному, Черное к черному
Я должен повторять это про себя не менее 100 раз каждый раз, когда провожу вестерн-блоттинг! Если электроды подключены к неправильному положительному/отрицательному выходу, электрическое поле будет противоположным, и ваши образцы будут вытекать из геля неправильным путем.
Эту ошибку очень легко совершить, но перепроверка почти не занимает времени.Перенос белков из геля на мембрану
Белки «Run to Red» или «Run to Anode»Простой способ запомнить, что и куда следует в вашем трансферном бутерброде, — это фраза «беги к красной». Если вы считаете, что белки будут течь из геля в выбранную вами мембрану, ваш гель должен быть на отрицательно заряженной черной стороне (катод), а ваша мембрана — на положительно заряженной красной стороне (анод), что точно так же, как течет ток.
Обращайтесь с мембраной правильно!
Всегда надевайте перчатки, убедитесь, что ваши щипцы чистые, и скатывайте пузырьки с переносного бутерброда. Как я уже говорил ранее, пыль и грязь БУДУТ появляться на вашем пятне! Пузырьки воздуха предотвратят миграцию белка из геля в мембрану в этой области, чтобы избежать этого, вы можете использовать небольшой валик или край пластиковой 50-миллилитровой пробирки, чтобы вытолкнуть любые пузырьки в сэндвиче для переноса.
Не допускайте перегрева переноски
Перекачка бака может выделять много тепла, что вызывает проблемы при перекачке. Чтобы решить эту проблему, убедитесь, что буфер для переноса предварительно подготовлен и у него было достаточно времени для охлаждения (его всегда можно приготовить накануне). Часто блоттеры могут поставляться с пакетами со льдом, которые можно вставить в резервуар, это поможет снизить температуру. Убедитесь, что ваши пакеты со льдом заполнены и заморожены, прежде чем переносить гели! Причем осуществить пересадку можно на льду или в холодном помещении. Снижение напряжения и уменьшение времени передачи также может уменьшить тепловыделение во время передачи. Вы можете попробовать разное время/напряжение и выяснить, что лучше всего подходит для вас и вашего белка!
Проверьте, сработал ли ваш перенос
Прежде чем приступать к этапам блокирования и иммунодетекции, полезно проверить, успешно ли ваши белки были перенесены из геля на мембрану.
Этого можно легко и быстро добиться с помощью белкового красителя, такого как Ponceau-S. С помощью этого метода вы также сможете определить, были ли какие-либо проблемы во время переноса, такие как неравномерный перенос или пузырьки воздуха, попавшие в сэндвич для переноса. Вы можете использовать это время, чтобы отметить ориентацию вашей мембраны карандашом, особенно полезно, если у вас нет видимой лестницы!
Блокировка и промывка
Теперь это могут быть самые важные шаги, когда дело доходит до минимизации фона на вашей мембране. Блокирование — важный шаг для повышения специфичности ваших антител путем блокирования неспецифических участков связывания антител. Чтобы заблокировать мои мембраны, я использую 5% BSA в TBS-T. Совет, который я принял, заключается в том, чтобы фильтровать этот раствор перед его использованием, это удаляет любые частицы, которые могут отображаться в качестве фона. Обычно я блокирую свои мембраны на 1 час при комнатной температуре. Другие часто используемые блокирующие агенты включают обезжиренное сухое молоко.
Необходимо промывать мембраны раствором TBS-T после каждого этапа инкубации антител. Я промываю свои мембраны 3 раза по 5 минут при легком встряхивании. Это удалит любое несвязанное антитело и, следовательно, уменьшит фон!
Антитела
Крайне важно протестировать ряд различных концентраций ваших антител и выяснить, что дает лучшую/самую чистую полосу на блоте. Производители антител часто предоставляют эту информацию в своих спецификациях. Слишком много антител, и вы можете увидеть чрезмерный фон на пятне, слишком мало антител, и вы можете вообще ничего не увидеть.Не забудьте включить контрольные образцы при тестировании антител. Например, дает ли вторичное антитело полосы без какого-либо первичного антитела? Если это так, это может привести к ложноположительному результату.
Обязательно дважды проверьте видовую реактивность ваших антител и их совместимость с вашими образцами.
Обнаружение
Я использую конъюгированные антитела IRDye от LI-COR, которые можно обнаружить с помощью их систем визуализации Odyssey®.
Эти красители можно обнаружить в каналах 700 или 800 нм.Устраните неполадки с концентрациями антител — если у вас слишком много вторичных антител, вы рискуете неспецифически связываться с вашей мембраной, и знаете что, у вас будет много предыстории! Более того, слишком много вторичных сигналов может быть связано с интересующей вас полосой и насытить сигнал, который вы не сможете измерить количественно. Обычно я вручную сканирую свои мембраны с помощью сканера Odyssey® с любой интенсивностью, поэтому я могу сказать, когда сигнал достигает максимума.
При обнаружении белков как в 700-нм, так и в 800-нм канале убедитесь, что ваши вторичные датчики специально обнаруживают правильный белок в правильном канале. Вторичные частицы с высокой степенью перекрестной адсорбции рекомендуются для обнаружения белков в обоих каналах, поскольку вероятность перекрестного взаимодействия между ними меньше.
Высокий фон в вестерн-блоттинге
Вестерн-блоттинг — это мощный метод анализа экспрессии белка.
С помощью этого единственного анализа можно оценить молекулярную массу отдельных белков, посттрансляционные модификации и распространенность. Вестерн-блоты относительно просты в выполнении и не требуют дорогостоящего оборудования или реагентов, что делает их основой для многих лабораторий.
Ключом к успешному вестерн-блоттингу является использование антител, которые специфически реагируют с одним белком и имеют небольшую перекрестную реактивность с другими белками. Успешный блот также зависит от получения соотношения сигнал/шум, которое позволяет обнаруживать белок с минимальным фоном. Высокий однородный фон и пятнистый неравномерный фон являются общими проблемами вестерн-блотов. В этой вики-записи описаны распространенные причины и решения для высокого фона в вестерн-блотах.
Равномерно высокий фон
Равномерно высокий фон — это фон, который затемняет все пятно, что затрудняет просмотр отдельных полос. Однородный фон может быть результатом множества причин.
Высокая концентрация антител
Если используются чрезмерно высокие концентрации антител, они могут насыщать и покрывать мембрану, связываясь неспецифически. Это приведет к равномерному высокому фону по всему пятну. При использовании усиленной хемилюминесценции (ECL) иногда блот даже светится в темноте.
Титрование антител
Чтобы уменьшить высокий фон из-за высокой концентрации антител, титруйте антитела. Дот-блот можно использовать для титрования как первичных, так и вторичных антител в шахматном порядке.
Недостаточное блокирование
Блокирование мембраны — важный этап, предотвращающий неспецифическое связывание антител с мембраной. Достаточное блокирование достигается путем инкубации блота в соответствующем блокирующем буфере. Тип блокирующего агента, продолжительность и температура инкубации могут влиять на эффективность блокирования.
Блокирующие реагенты
Выбор блокирующего реагента зависит от конкретного взаимодействия антиген:антитело и лучше всего определяется эмпирически.
Сухое обезжиренное молоко обычно используется в качестве первого выбора. Часто для блокирования рекомендуется использовать 5% молоко, однако иногда такая концентрация молока может маскировать обнаруживаемый белок, особенно если его не много. Мы рекомендуем начинать с 1% молока.
Молоко может быть несовместимо с некоторыми антителами и системами обнаружения (см. Помехи из-за несовместимых блокирующих агентов), и в этом случае 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) является вторым блокирующим агентом на основе белка, который можно использовать.
Несколько компаний продают безбелковые блокирующие агенты, такие как AdvanBlock-PF от Advansta. Агенты, не содержащие белков, предотвращают интерференцию, но их также можно использовать в сочетании с агентами на основе белков для повышения блокирующей способности.
Продолжительность и температура инкубации
Блокирования в течение 1 часа при комнатной температуре с перемешиванием обычно достаточно для блокирования мембраны.
Однако блокирование также можно проводить в течение ночи при 4°C при перемешивании.
Помехи от несовместимых блокирующих агентов
Однородный высокий фон может наблюдаться при взаимодействии блокирующих агентов с антителами, вызывающими интерференцию. Например, антитела могут связываться с белками блокирующих агентов на белковой основе, что приводит к высокому однородному фону. В частности, сыворотка животных, содержащая неочищенные первичные антитела, может связываться с белками животного происхождения в составе блокирующих реагентов. Кроме того, обезжиренное сухое молоко может специфически реагировать с некоторыми антителами или реагентами для обнаружения. Молоко содержит казеин, фосфопротеин, который может реагировать с фосфоспецифическими антителами. Молоко также содержит различные количества авидина, которые могут мешать работе систем обнаружения авидина-биотина. Оба этих взаимодействия приведут к высокому однородному фону.
Испытание различных блокирующих реагентов
Для каждой комбинации антиген:антитело следует определить соответствующий блокирующий агент.
Как обсуждалось выше, двумя наиболее распространенными блокирующими агентами являются обезжиренное сухое молоко и бычий сывороточный альбумин. Если ни один из этих агентов не является адекватным, то можно использовать реагенты, не содержащие белков или реагенты, блокирующие белки неживотного происхождения, такие как AdvanBlock. В качестве альтернативы в качестве блокирующего реагента можно использовать нормальную сыворотку того же вида, что и животное, у которого было получено первичное антитело.
Недостаточная промывка
Важно тщательно промыть блот после инкубации с первичными и вторичными антителами, чтобы удалить избыток антител. Плохая промывка может способствовать высокому однородному фону.
Изменение объема, продолжительности и количества промывок
Проводить промывки в больших объемах, часто менять промывочный раствор и встряхивать мембрану во время этапов промывки. Рекомендуемый протокол — промывать мембрану 3 раза после каждой инкубации, промывая по 5 минут на промывку.
Количество стирок и продолжительность мытья могут быть увеличены для повышения эффективности мытья; однако чрезмерная промывка может снизить мощность сигнала.
Повышение жесткости стирки с моющим средством
Строгость этапа стирки можно повысить, добавив моющее средство в моющий раствор для нарушения неспецифических взаимодействий. Твин-20 (0,05%) обычно используется в промывочных буферах. Можно использовать немного более сильное моющее средство, такое как 0,05% NP-40, чтобы повысить жесткость стирки. Примечание. Следует использовать только моющие средства высокой степени очистки, так как примеси в моющих средствах могут мешать работе систем обнаружения пероксидазы хрена. Моющее средство следует добавлять в моющие растворы свежим, так как моющие средства могут способствовать росту бактерий и вызывать высокий фон (см. Бактериальное загрязнение).
Мембрана
Различные типы мембран (нитроцеллюлоза или ПВДФ) и поставщики и/или поставщики мембран могут влиять на уровень фона.
Возраст мембраны и то, как с ней обращаются, также могут влиять на степень полученного фона.
Типы мембран
Выбор мембраны следует определять эмпирически для каждой комбинации антиген:антитело. Мембраны из нитроцеллюлозы, как правило, дают самый низкий фон, однако они хрупкие, их нельзя снять и повторно исследовать, и многие из них не связывают более мелкие белки. Мембраны из поливинилидендифторида (ПВДФ) обладают высокой связывающей способностью, но могут давать более высокий фон.
Работа с мембранами
Мембраны из ПВДФ требуют активации в метаноле и уравновешивания в воде перед использованием. Высокий равномерный фон будет виден, если эти шаги пропущены или выполнены неправильно. Обратитесь к инструкциям производителя для протокола.
Мембраны никогда не должны высыхать, так как это также приведет к высокому однородному фону.
Использование предварительно нарезанных мембран, таких как предварительно нарезанные мембраны из ПВДФ или нитроцеллюлозы, продаваемые Advansta, может свести к минимуму обращение с грязными ножницами и контакт с ними.
Источник мембраны
Фоновые уровни также могут различаться в зависимости от производителя мембраны. Если виден высокий фон, можно попробовать другой источник для более низкого фона.
Возраст мембраны
Старые мембраны могут давать высокий однородный фон, поэтому обращайте внимание на срок годности и используйте более новые мембраны для уменьшения фона.
Бактериальное загрязнение
Бактериальное загрязнение буферов может привести к высокому фону.
Буферы, содержащие моющее средство и молоко, которые могут способствовать росту бактерий, должны быть свежими.
Переэкспонирование мембраны
Длительное время экспозиции улучшает общий фон без повышения чувствительности.
Можно попробовать несколько вариантов уменьшения времени экспозиции. Если возможно, загрузите больше белка, чтобы увеличить содержание целевого антигена. Убедитесь, что первичное антитело хорошо оттитровано.
Попробуйте другие первичные антитела, если они доступны. В качестве альтернативы используйте реагент для обнаружения, разработанный для белков с низким содержанием, например субстрат WesternBright Quantum HRP компании Advansta.
Пятнистый, неравномерный или крапчатый фон
Помимо высокого однородного фона вестерн-блоттинг может включать неровный пятнистый фон, случайные черные пятна, белые пятна или просветы, неровные полосы и случайные крапинки. Есть несколько причин для такого типа фона.
Грязь
Хемилюминесцентные реагенты притягиваются к пыли и грязи, которые могут попасть на блот во время промывок или попасть на блот с грязного оборудования. Фон из пыли и грязи обычно виден в виде случайных крапинок на кляксе.
Старт без грязи
Во избежание загрязнения пылью и грязью вымойте все оборудование, которое соприкасается с мембраной, в том числе переносное устройство и лотки, используемые для инкубации.
Отфильтруйте все буферы и растворы для удаления частиц. Накрывайте посуду крышками, чтобы пыль не попадала в растворы во время инкубации.
Пузырьки воздуха
Если пузырьки воздуха находятся на мембране во время переноса, они будут препятствовать прилипанию белков к мембране. Если пузырьки прикрепляются к мембране позднее, они могут препятствовать доступу блокирующего раствора или антител к мембране. Пузырьки воздуха могут привести к образованию пятен, белых кругов или просветов, а также неполных полос.
Пузырьки воздуха во время установки переноса
Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха при настройке переноса, осторожно прокатайте пипеткой каждую часть в стопке «сэндвич» (мембрана, фильтровальная бумага, губка для переноса) после ее установки на место.
Пузырьки воздуха во время переноса и инкубации
Воздух образуется в буфере для переноса из-за смешивания метанола с водным буфером.
По возможности подготовьте буфер для переноса за 1-2 дня. Если необходимо использовать свежий буфер, дегазируйте буфер фильтрацией, вакуумированием или обработкой ультразвуком. Кроме того, передача при более низком напряжении для предотвращения пузырьков.
Избегайте слишком энергичного перемешивания блота во время инкубации и образования пузырьков.
Неправильное обращение с мембраной
Пятна, линии и темные пятна часто возникают из-за неправильного обращения с мембраной.
Манипуляции с мембранами
Всегда держите мембраны в перчатках и используйте щипцы для манипуляций. Масла на руке вызовут темные пятна. Будьте осторожны, чтобы не согнуть мембрану, образуя складки, это приведет к темным линиям. Не царапайте мембрану при добавлении растворов или использовании щипцов. Убедитесь, что мембрана насыщена растворами во время инкубации, чтобы предотвратить высыхание участков.
Активация и уравновешивание ПВДФ
При использовании ПВДФ важно активировать мембрану, а затем уравновесить ее в водном растворе, как описано выше.
Когда метанол реагирует с водными растворами, образуются пузырьки воздуха, которые могут прилипать к мембране и препятствовать уравновешиванию и диффузии, создавая пятнистый фон. Убедитесь, что мембрана уравновешена в соответствии с инструкциями производителя. Если между растворами существует разница температур (т. е. вода холодная, а метанол имеет комнатную температуру), то метанол может не вытесняться должным образом; поэтому старайтесь поддерживать постоянную температуру при подготовке мембраны.
Недостаточное смешивание компонентов буфера
Компоненты буфера, такие как детергенты и блокирующие агенты, могут прилипать к мембране и вызывать появление темных пятен, если они не полностью растворены. Это особенно характерно для обезжиренного сухого молока.
Полностью перемешайте компоненты буфера
Убедитесь, что все растворы тщательно перемешаны перед использованием; блокирующие растворы можно перемешивать. Растворы также можно фильтровать перед использованием.
Антитело неравномерно распределяется во время инкубации
Неравномерный пятнистый фон или неполные полосы могут возникать, если антитело неравномерно распределяется по мембране во время инкубации.
Держите мембрану покрытой растворами
Используйте достаточное количество раствора антител, чтобы полностью покрыть мембрану. Встряхивайте блот на шейкере во время инкубации.
Избыточное количество реагентов для детекции на блотах
Если реагенты для детекции неравномерно скапливаются на мембране, это может привести к пятнистому фону.
Удаление избытка реагентов для детекции
Для удаления избытка реагентов для детекции осторожно промокните белковую сторону мембраны салфеткой Kim-wipe или быстро опустите мембрану на фильтровальную бумагу, чтобы впитать жидкость. Оберните мембрану полиэтиленовой пленкой перед воздействием, чтобы предотвратить дальнейшее высыхание.